新设计的全人源化VHH抗体免疫文库筛选具有较高成药性的驼源抗体
这篇文献的主要内容是建立了一个新的方法从羊驼免疫文库筛选人源化的VHH。为了达到这个目标，将来源于免疫后羊驼VHH的CDR3移植到人源化的VHH框架区；这个VHH的框架区来源于人的抗体基因CDR1和CDR2包含一些多样性突变，在设计这些CDR突变的时候通过计算方法提高了抗体的可开发性、抗体序列的可靠性以及消除了免疫源性；然后通过酵母展示筛选VHH抗体。筛选的抗体具有高亲和力且通过计算模拟抗体的可开发性也比较好，表达后的VHH抗体具备较好的理化特性、生物学活性且不需要额外的优化。这种方法使用于所有抗原免疫的羊驼，可以在较短的的开发周期内获得成药性较好的人源化VHH抗体并且降低开发方法。
话不多说，咱们进入主题。整个实验的流程比较简单，免疫羊驼，收集PBMC，扩增CDR3区域插入人源化的抗体框架区，构建人源化的VHH抗体酵母文库。
文库设计
人源化的框架区来自人IGHV3-23x1，因为这条序列与羊驼的相似度最高。然后将序列中FR2中的四个氨基酸进行更改，据此设计了两个框架序列第一条为“FERF”(37F，44E，45R和47F)，第二条为“VGLW”(37V，44G，45L和47W)。另外为了防止只移植CDR3会丢失亲和力，因此在CDR1和CDR2中引入一些突变，因为突变的位点不多，因此框架区文库的多样性大概在1e4，这些位点的突变是根据羊驼天然或者免疫后的抗体序列进行统计分析获得，在设计文库的同时将序列中可能出现的PTM位点进行了改造，将可能结合MHC-II的序列基序进行消除，在兼顾多样性的同时也考虑到氨基酸残基的电荷、体积以及疏水性等，最终的文库序列也跟人源抗体对应位置出现的氨基酸频率一致。在框架区文库的CDR3区域引入stuffer序列并加入终止密码子，两端加上BsaI酶切位点。扩增VHH抗体CDR3的时候在引物两端加上人源FR3和FR4序列进行同源重组。下表列出NGS测序后的序列与理论序列的对比结果，每个位点下面的氨基酸是人IGHV3-23x1对应位点的氨基酸，从结果来看获得序列跟理论序列基本一致。
建库
根据上述的步骤使用NKp46免疫后的羊驼PBMC构建酵母文库，为了比较这种建库方法的可靠性同时也做了传统的VHH免疫文库命名为“WT”，然后分别对三个文库进行筛选，能够看到较好的富集。
从每个文库富集的克隆中各挑选了96条进行测序，并对获得的序列根据CDR3的长度和相似度进行聚类，分析的结果显示从WT、FERF以及VGLW文库获得序列分布基本一致。
同时对于同一个簇内的抗体CDR1和CDR2进行分析发现这些位点基本也有较好的多样性。事实上从免疫库或者设计的文库中基本不可能获得完全一样的CDR1-CDR2-CDR3，不过所有的序列中有50%以上的VHH抗体具有一样的CDR3。
最后从中挑选了49条序列进行分析，主要比较从设计的全人源文库获得抗体是否比传统的抗体具有更高的亲和力或者具有更好的可开发性，另外就是比较全人源文库的抗体CDR1以及CDR2的序列对结合以及可开发性具有多大的影响。
抗体成药性分析
接下来对这些序列进行可开发性的分析，使用的是SUMO，分析的内容主要包括对抗体进行建模、计算人源化的比率并搜索相似度最高的人源胚系基因、定位暴露在溶剂中的化学稳定性基序(未配对半胱氨酸、甲硫氨酸、脱酰胺、异构化位点)、潜在的N糖位点、另外还包括抗体PI、抗体疏水性质和聚集倾向、抗体CDR附近正电荷聚集的情况等。从结果来看人源化抗体文库的序列与人源胚系基因的相似度更高。
抗体可开发性数据检测
将筛选后的抗体表达出来并进行检测，表达的抗体为单臂VHH-Fc融合蛋白形式下图A，同时也是为后面表达双抗做准备下图B。这边非对称CH3技术为SEED，并且在GA链引入RF突变以消除GA:GA二聚物跟protein A的结合能力。
下图是表达的单臂抗体的一些理化以及结合数据。从SEC纯度来看各个组之间并没有差异；HIC的保留时间上WT VHH和FERF的保留时间比较正常但是VGLW的保留时间更长意味着这些位点的突变使VHH更疏水；Tonset的数据组间也比较一致，说明VHH的稳定性较好，而且人源化文库的VHH也有较好的稳定性；抗原结合能力FERF与WT VHH比较类似，但是VGLW的抗体亲和力更低。
双抗杀伤
使用筛选到的NKp46 VHH表达EGFR x NKp46双抗并检测活性，其中抗体的Fc区域经过突变消除效应功能。表达的双抗都具有较好理化性质，体外杀伤使用的是高表达EGFR的A431细胞。
这边的结果看看就行，总体来说筛选的抗体理化性质良好，跟抗原的结合能力也比较强，部分抗体做成双抗也有一定的功能，因为纳米抗体的结构导致它只能结合某些特定的表位，因此他们筛选的抗体基本都是一个表位的。
讨论
这篇文章主要提供了一个人源化抗体免疫文库的建库思路，将免疫的羊驼CDR3序列构建到经过设计的VHH抗体框架区中，并从中筛选人源化的VHH抗体。这类似于一种半合成半免疫的文库，兼具两种文库的优点，首先框架区的免疫源性更低、可开发性更好，其次因为CDR3是来源于免疫过的动物，因此这种文库的库容并不需要太大，最后这个抗体筛选到的直接就是人源化抗体，不需要后续的优化。从文中的结果我们也能看到FR2部分的氨基酸对抗体的亲水性以及亲和力确实具有较大的影响不过也需要进一步的分析哪群抗体的FR2区域是携带FERF和VGLW，这跟他们的CDR3结构是否有关。
参考文献
- A library approach for the de novo high-throughput isolation of humanized VHH domains with favorable developability properties following camelid immunization
