基于结构的电荷计算，用于预测等电点、黏度、清除和抗体分析

众所周知，较高的疏水性容易引起抗体聚集，抗体携带的电荷也会影响高浓度下的抗体黏度以及体内的PK清除率。这篇文章作者评估了基于结构的电荷计算对抗体pI、黏度和清除率数据的预测性能，使用的软件为MOE。

背景

在生物治疗药物开发的候选发现、工程和先导优化阶段，为避免可开发性风险所做的努力现在越来越多。一些小规模的生物物理和基于细胞的检测方法现在可以作为晚期发展问题的替代品，如聚集性、黏度、多特异性和热稳定性。抗体发现人员更常进行此类测试，以帮助选择先导抗体候选物并优化它们以改善生物物理特性。在互补决定区（CDR）增加疏水表面积的浓度通常会导致抗体候选药物的可开发性降低。

电荷是另一个重要的性质，电荷种类可以用来预测高浓度黏度，有时可以在聚集中发挥作用。去除带负电荷的残基或向CDR中添加带正电荷的残基可以降低IgG1抗体的黏度，即Fv电荷越高，黏度越低。空间电荷图(SCM)表明CDR上带负电荷的斑块越大，黏度越高。电荷和pI值较高的单克隆抗体具有较好的溶解行为和较低的黏度。

电荷也可以对药代动力学(PK)清除产生影响。电荷介导的相互作用也会抵消FcRn的作用，并且Fv高正电荷和高疏水性可用于过滤食蟹猴中半衰期短的抗体。降低CDR表面疏水性可以提高抗体可开发性，避免IgG1抗体CDR表面的负电荷和极值电荷分别有利于黏度和PK。

抗体pI计算

对22个提供完整序列的抗体建立了全长抗体模型，并采用三种不同的方法计算其pI值:基于序列的方法(pI_seq)、PROPKA 3D方法(pI_3D)和力场电荷法(ens_pI)。预测结果与实验结果的相关性如图1(a,b)所示，pI_seq和pI_3D描述符具有同样高的相关性(0.97)，但pI_3D具有更低的标准误差(以exp_pI单位为0.07)。值得注意的是，这组抗体在恒定区域有变化，为了产生准确的pI预测，对全长进行建模是至关重要的。在这种情况下，仅对Fv或抗原结合片段(Fab)进行建模不足以进行绝对或相对pI预测，需要对全长抗体四聚体进行建模。HzATNP是一种人源化IgG4抗体，在储存时形成大量聚集体，因此经过优化以提高可开发性。除了如HIC和CIC之类的可开发性实验，也测量了pI。文中为17种IgG4抗体创建了全长抗体模型，pI值与预测值之间的相关性如图1(c,d)所示。pI_3D描述符具有最高的相关性(r = 0.95)和相对较低的标准误差(s = 0.07)。

抗体黏度预测

使用了包含 38 种 IgG1 抗体变体的抗体黏度数据集，其黏度数据以黏度达到20 cP时抗体的浓度 (mg/mL)的形式提供。对每个抗体的可变结构域进行建模，并计算各种三维描述。ens_charge描述与黏度测量值的相关性最高，Pearson系数为0.72。这种关系的散点图如图2所示。相关性表明，不同的电荷突变体形成两个簇，其中低电荷组的突变体具有更严重的黏度，但在两个单独的组内没有相关性。patch_cdr_pos和pI_3D描述符也与其他一些预测工具类似。因为实验是在pH 5.8时进行，当ens_charge_Fv计算的pH设定为5.8时(而不是默认pH为7.4)时，对相关性没有改善。如果使用102 mg/mL作为20 cP黏度的阈值，则该数据集可以通过ens_charge_Fv描述符进行分类，总体精度为87%(见表1)。表现良好的变体具有+2或更高的ens_charge_Fv，因此，具有更多正电荷的可变结构域对于改善这38种IgG1变体的黏度至关重要。

接下来对27个上市抗体的Fv区模型，计算了ens_charge_Fv，并与150 mg/ml时报告的黏度(cP)进行了比较。同样，ens_charge_Fv越低，抗体黏性越强，Pearson系数为0.55。此外，去除IgG2和IgG4抗体将相关性提高到0.63(图3)。在上面的例子中建立的ens_charge_Fv +2的阈值消除了5种高粘性抗体中的2种(40%)，同时保留了16种非粘性抗体中的15种(94%)。

抗体PK预测

Kraft等人提出肝素作为内皮细胞上带高度负电荷的成分的替代物，使用肝素色谱法作为预测潜在的胞质摄取和降解的方法。文中提供了130种抗体的肝素保留时间，以类似于上述黏度数据集的方式建模。en_charge_fv描述符与肝素保留时间相关，Pearson系数为0.72(见图4)，其中电荷越高，在带负电荷的肝素内衬柱中保留时间越长。

抗体CST分析

文中从治疗性结构抗体数据库(Thera-SAbDab)中获得的总共629个CSTs被建模使用patch_cdr_hyd、ens_charge_Fv和CDR长度(cdr_len)描述符来分析CSTs。如表3所示，629种CSTs中有114种已获得FDA批准(18.1%)。首先设定patch_cdr_hyd阈值为530 Å2，因为该值对人类PK数据预测很有用，它过滤了大约10%的候选数据。第二，ens_charge_Fv的范围从−2.5到8.5，它大约过滤了5%的CST。然后，CDR的长度(cdr_len)使用从61到75的窗口筛选掉41种抗体，其中有5种已被批准。对于Fv_chml电荷分离，使用−4到+4的窗口，过滤出83个抗体，其中有11个被批准，它是这四个规则中富集到最多获批抗体的方法。能够通过所有4条筛选规则的抗体有445条，其中获批上市的有89条(20%)。如果排除掉未能通过任何一个条件的抗体则共获得184个抗体而其中只有25个(13.6%)获得批准，这个数字远低于全部629个抗体的18.1%。

单抗同型电荷差异

大多数已发表的关于聚集、黏度和PK的数据都与表达为人类IgG1同型的抗体有关。为了确定从这些数据中得到的概念是否可以跨同型传递，了解IgG1、IgG2和IgG4恒定区域的电荷差异是很重要的。为此，文中建立了全长抗体模型，来计算pH为7时的净电荷，其结果总结于表4。

IgG1的恒定区带正电，而IgG2和IgG4的恒定区带负电。IgG1恒定区上的正电荷是每个CH1区域上的+2电荷的结果，总电荷为+4。IgG2的CH1结构域和Fc结构域携带负电荷，而IgG4具有中性CH1结构域和携带负电荷的Fc结构域。Fv的电荷取决于抗体的胚系基因和CDR部分。629个CST的IgG1 ens_charge_Fv中值为+4，这与C1结构域上的电荷相似，阻止了分子内偶极子的产生。IgG2和IgG4 CST的中位ens_charge_Fv分别为+4和+3。N端为ens_charge_Fv贡献了+2，形成了Fv区观察到的大部分正电荷。同样，轻链的C端向每个C1结构域提供−1个电荷，而重链的C端向Fc结构域提供−2个电荷。映射到3D模型上的电荷如图7所示。将两个成药性较好且低黏度的抗IL-13 IgG4抗体和抗IL-17 IgG1抗体做成双特异性结构时，将IgG1抗体的Fv结构域替换掉IgG4抗体的一个Fv结构域，得到的双特异性抗体具有较高的黏度。

结论

研究结果表明，基于序列和结构的pI计算可以准确预测人类IgG1和IgG4抗体的实验值。如果在恒定区存在突变，则需要结合序列/结构来计算，对于pI的计算不能单独使用Fv而要使用全长序列/模型。基于结构的pI_3D描述符与实验测量值的相关性最高，但其相关性并不显著高于基于序列的方法。对于黏度，ens_charge_Fv可以将IgG1抗体分成两个集合，低ens_charge_Fv高黏度和高ens_charge_Fv低黏度，使用ens_charge_Fv将阈值设定到+2预测的数据与SCM和PROPKA类似，而且使用本方法你只需要对Fv进行建模即可。使用ens_charge_Fv来预测PK也具有一定的相关性，特别是具有较高的ens_charge_Fv值的抗体，pI_3D的值在6.7-9.05范围的抗体具有较低的清除率，patch_cdr_hyd 低于 530 Å2的抗体清除率较低，这说明在筛选抗体的时候需要避免那些具有较高电荷以及较大疏水区域的抗体。

本文对一些关键参数设定了阈值来对629个CST进行筛选，从筛选结果看仅仅使用这些规则基本不可能将获批上市的抗体富集出来，当然抗体的成功上市除了与成药性有关还与其他的因素相关，尽管如此仅仅使用软件进行预测筛选是不明智的。

参考文献：

MABS 2021, VOL. 13, NO. 1, e1981805 (11 pages) . doi.org/10.1080/19420862.2021.1981805