ADC开发
ADC由毒素、连接子以及单抗所组成，通过单抗将毒素递送至表达肿瘤相关抗体的靶细胞来扩大毒素的治疗窗口。尽管ADC的开发热度异常火爆，但是目前仍旧面临许多挑战，如ADC的作用机制、新毒素的开发、毒性与疗效的平衡、生物标记物、与标准疗法的联用以及ADC药物的耐药机制等等。
许多证据表明，ADC的抗肿瘤功能取决于抗体、连接子和毒素，其中每一个都会参与ADC与肿瘤以及肿瘤微环境之间复杂的相互作用，不同ADC之间的这些成分的差异会影响其药学和临床特性。
抗体以及抗原的选择
目前大部分的ADC还是选择IgG作为骨架，其中大部分上市的ADC使用的是IgG1，上市的ADC中使用IgG4的只有两个，少部分临床阶段的ADC在测试IgG2，IgG3由于其较短的PK基本没人选择。
关于选择理想的ADC靶点，一个重要指标是在肿瘤细胞上高表达但在正常细胞上不表达或者低表达，ADC旨在将其毒素递送至所有表达靶抗原的细胞，因此与正常组织相比，在肿瘤中优先表达的靶标具有更宽的治疗窗口，并降低全身毒性的机会。除了肿瘤特异性之外，其他几个靶点相关因素也会影响ADC的功效，如靶点表达的异质性、靶点的循环速率、内化速度、溶酶体降解途径都会影响ADC的抗肿瘤活性。最后靶点的肿瘤驱动特性也是一个重要的考量，此类靶点较少会通过下调而导致耐药，同时抗体也能通过阻断其通路而增加额外的抗肿瘤效果。
连接子的类型
自从ADC的概念提出以来，连接子的发展也取得长足进步，甚至可以说连接子的发展决定了ADC今日的发展盛况。连接子的开发主要有两个目的，首先是保持ADC在循环中的稳定，血浆中不稳定的连接子会过早的释放毒素引起系统毒性并减少毒素在肿瘤部位的释放；第二点是能够在肿瘤内特别是癌细胞内释放毒素。
目前开发连接子主要包括两类：可裂解和不可裂解。可裂解连接子通过酸性、还原条件或者蛋白水解酶等肿瘤相关的因素发生裂解从而释放毒素，许多研究表明可裂解连接子在循环中表现出不同程度的稳定性，并且会随着时间的推移在血浆中降解。不可切割的连接子在血浆中往往更稳定，但依赖于整个抗体结构的溶酶体降解来释放其毒素，通常导致带电氨基酸保留在毒素上，这可能会影响其作用或细胞渗透性。
毒素
早期的ADC携带传统化疗药物，例如甲氨蝶呤、阿霉素或长春花生物碱，这些ADC并不比传统化疗更有效，通常需要更大的剂量才能有抗肿瘤活性这也进一步限制了临床使用。有研究报道，肿瘤靶向单克隆抗体的给药剂量中只有很小一部分到达肿瘤组织（约0.1%），这意味着需要具有更大细胞毒性的有效负载才能达到治疗效果，因此在前几年ADC的开发中选择的都是高毒性的的毒素分子，直到Sacituzumab govitecan-hziy和Trastuzumab Deruxtecan的成功才将目光转到较低毒性的喜树碱类的毒素上，目前低毒高DAR是ADC领域的主要趋势。
ADC的DAR值也是一个重要因素，不同ADC的DAR从2到8不等，这主要是根据靶抗原的分布、毒素的药学性质以及活性所决定。目前来说喜树碱类的毒素因其毒性较低可以做到DAR4-8，微管抑制剂或者DNA烷化剂一般为DAR2-4，更高的DAR值对应更高的抗肿瘤活性，早期由于偶联技术的局限高DAR会增加ADC的疏水特性，例如高DAR的ADC可能会更快地从血浆中清除，减少肿瘤ADC暴露，并在临床前模型中产生与具有较低DAR的ADC相当的活性，现在可以通过增加连接子的亲水性来避免，从而很容易做到更高DAR值。
毒素分子的疏水性也被认为是一个重要因素，特别是在“旁观者效应”方面。与HER2表达同质的乳腺癌相比，肿瘤内或肿瘤间HER2表达异质性较高的乳腺癌对T-DM1的反应较差，而Trastuzumab Deruxtecan通过其旁观者效应可以对旁边HER2低表达的肿瘤细胞进行杀伤。
ADC的作用机制
尽管根据不同的连接子以及毒素类型ADC的作用机制所有差异，不过目前对ADC作用机制的模式如下：抗体与目标抗原结合，随后ADC被内化，最后连接子裂解和细胞内毒素释放。
ADC给药后在循环中可以检测到ADC、裸抗和小分组毒素三个组分。不同ADC会有所区别，主要取决于连接子稳定性和ADC纯度均一性等，并且在给药后的随后几天不断变化。例如T-DM1的临床药代动力学研究发现，血清中的总抗体浓度超过T-DM1大约20%，总曲妥株单抗的PK约为9-11天，T-DM1的PK为4天左右，这可能是由于T-DM1的清除较快、连接子不稳定或者抗体循环所导致。这些发现表明 ADC在体内以动态混合物存在，这不但使药理学模型复杂化而且影响这些药物的临床特性。
与传统的化疗相比，单克隆抗体是大分子这一特性限制了它们向肿瘤的穿透。肿瘤中的血管异常、跨毛细血管压力梯度以及基质组织成分都会阻碍抗体向肿瘤渗透。抗体从毛细血管外渗后，通过缓慢、低效的被动扩散到达肿瘤细胞，整个过程只有给药剂量0.1%的抗体能够真正进入肿瘤，这也再次强调要么递送更强毒性的毒素要么递送更多的低毒毒素进入肿瘤。在动物模型中使用标记药物的研究数据表明，使用现有的ADC，肿瘤组织中的药物浓度通常在给药后1-2天内达到峰值，肿瘤内的药物水平可能超过其在正常组织中浓度的100倍，尽管这些参数在不同的ADC之间可能会有很大差异。抗体的亲和力也会影响药物的肿瘤穿透，高亲和力会因为“binding-site barrier”而结合在血管周边难以进入肿瘤内部的细胞。
ADC进入肿瘤组织后，需要结合到靶抗原才能发挥其抗肿瘤活性。ADC依旧保持其裸抗的活性，因此可以在释放毒素前就发挥抗肿瘤活性。例如T-DM1和T-DXD均能通过抑制HER2信号抑制肿瘤细胞也可以通过Fc效应功能杀伤肿瘤细胞。
抗原结合后，ADC-抗原复合物的内化是许多ADC释放毒素的关键步骤，ADC内化可通过抗原依赖性内吞过程或抗原非依赖性胞饮过程发生。内化后，ADC-抗原复合物沿着内体和/或溶酶体途径运输。使用酸可裂解接的毒素可能会在早期内涵体中释放，而使用酶促裂解或通过蛋白水解降解的连接子则在晚期内涵体或溶酶体中释放毒素。虽然许多ADC被设计成在肿瘤细胞内释放其毒素的方式，但越来越多的证据表明，由于肿瘤微环境中的氧化还原环境、低pH和细胞外蛋白酶，大多数连接子类型都可以在肿瘤组织中释放毒素并且可能在抗癌活性中也发挥重要作用。
毒素的旁观者效应可以对靶抗原异质性表达的肿瘤有更好的抑制效果，对于内化ADC，这种特性需要亲脂性毒素跨细胞膜扩散。释放不带电荷毒素分子是发生旁观者杀伤所必需的，而使用不可裂解连接子的ADC释放的带电荷的毒素更倾向保留在细胞内。在体外将阳性细胞和阴性细胞混合后，具有旁观者效应的ADC可以杀伤阴性细胞，同时旁观者效应的速度还取决于阳性细胞的百分比，不过细胞外释放毒素的ADC可能较少依赖这些旁观者效应。
治疗难治性癌症的活性
经过数论治疗的难治癌症具有较高的基因组不稳定，导致肿瘤间和肿瘤内的异质性，肿瘤微环境也更加缺氧以及免疫抑制，姑息化疗是常用的手段，但是由于系统暴露导致的毒性限制了化疗的剂量，而ADC能够选择性地将细胞毒性药物靶向递送至肿瘤组织，并具有一致的免疫刺激功能。此外，缺氧低pH的肿瘤微环境可能促进连接子裂解和毒素释放，同时旁观者效应在肿瘤渗透后提供不加区别的细胞毒性，这可以克服肿瘤异质性。因此，ADC似乎甚至适合为接受过大量治疗的癌症患者带来益处。 在晚期实体瘤中ADC都显示出比化疗更优的治疗效果，如T-DM1在既往接受过曲妥珠单抗和紫杉醇治疗的转移性 HER2阳性乳腺癌患者中依旧能有43.6%的ORR，而下一代HER2靶向ADC T-DXd在先前接受过T-DM1并且经历5线治疗的转移性HER2阳性乳腺癌患者中的ORR为60.9%。这些临床结果带来几个问题，1）ADC为什么可以在相同靶点或者类似机制的药物耐药的肿瘤中依旧有效？例如T-DM1（抗体部分为曲妥株毒素为DM1）可以在曲妥株和微管抑制剂化疗药物耐药的肿瘤患者中依旧有效；T-DXD在伊立替康经治的患者中依旧能有41.7%的ORR，略低于全部人群的51%，高于伊立替康化疗的14%。2）尽管具有相同的抗HER2抗体骨架，为什么T-DXd在T-DM1难治性癌症中表现出活性？与T-DM1相比T-DXd具有可裂解的连接子和更高的DAR，此外，其携带的有效负载与T-DM1有很大不同，这些不同的因素可能是T-DXD克服肿瘤对T-DM1耐药的原因。3）如前所述，肿瘤的异质性是肿瘤对治疗耐药的主要因素，具有可裂解连接子和膜渗透性毒素的ADC可以通过旁观者效应产生额外的活性，从而加强了毒素对靠近抗原阳性细胞的抗原阴性细胞的细胞毒性，不过，必须权衡旁观者效应的潜在好处与任何潜在的相关毒性风险的增加，因为旁观者效应对肿瘤微环境中的非肿瘤细胞或免疫细胞的作用尚未可知。以上都说明ADC的毒素、连接子连接子都可能都对其临床效果起到重要作用，所以在某些肿瘤中观察到的肿瘤对某些化疗药物的耐药可以通过ADC的开发来克服。
毒性问题
ADC最初设计的出发点是通过肿瘤靶向来减少现有化疗药物引起的毒性，然而在临床上还是观察到严重的AE。传统的化疗药物分布在全身，因此这些药物的毒性特征很大程度上取决于其作用机制以及这些机制对粘膜、神经或皮肤等正常组织的破坏。
对于ADC目标抗原的表达模式会影响细胞毒性药物的分布及其积聚位置，这有时会导致显著的“on-target, off-tumour”毒性，而这些毒性有时是靶点相关的如enfortumab vedotin治疗后40%的患者味觉障碍，这可能与唾液腺中nectin 4的表达有关，尽管具有相同的毒素和链接子以及类似的DAR，但brentuximab vedotin、polatuzumab vedotin和enfortumab vedotin似乎具有不同的毒性特征。对于HER2靶向的疗法T-DXd和trastuzumab duocarmycin具有不同的毒素，均通过未知机制引起肺部毒性，并且T-DM1以及曲妥珠单抗也能观察到较小程度的此类毒性，不过曲妥珠单抗常见的心肌炎在ADC中则不太常见。
除了上述的靶向毒性外，“off-target, off-tumour”似乎主导了大多数现有ADC的毒性特征，如MMAE与贫血和/或中性粒细胞减少症和周围神经病变有关，MMAF和DM4与眼毒性相关，这种脱靶毒性可能归因于毒素在循环、非肿瘤组织或TME中的释放以及毒素对正常组织的破坏。重要的是，这些毒性模式可能与毒素类别或作用机制没有具体关联，并且毒素之间毒性的差异可以揭示连接子和毒素结构中的微妙化学变化如何影响临床效果。例如无论ADC的靶点如何，MMAF都会出现眼部毒性而MMAE则不会尽管这两种药物都属于auristatin类别。也有一些ADC在眼部表达，但是并没有带来眼部毒性，这可能是因为靶抗原在正常组织的表达水平不足以引起毒性。另外正常细胞也可能通过非靶点依赖性如巨胞饮作用或通过与Fc受体结合来摄取ADC，其中胞饮作用被认为是眼部毒性的主要因素。
还有特殊的毒性案例，同一个ADC根据研究的肿瘤类型导致不同的毒性模式，在相同剂量下glembatumumab vedotin导致30%的黑色素瘤患者出现严重皮疹但乳腺癌患者只有4%出现严重皮疹。这些复杂的因素使得ADC的安全性很难根据其成分来预测，这些挑战强调了在这些药物的临床试验中需要密切监测、仔细的剂量选择以及认真的AE报告和归因。
ADC的耐药
根据前面的一些内容ADC的耐药是一个复杂的科学问题，详细了解药物耐药机制可以深入了解药物作用的基本机制，并促进预测生物标志物的开发以改善患者选择。初步ADC耐药机制的研究数据表明细胞可以通过几个机制步骤逃避ADC杀伤，包括抗体-抗原结合、ADC内化、处理以及毒素作用机制等。
ADC的治疗效果与靶标的表达水平正相关，例如HER2靶向的ADC根据其表达水平ORR也有所差异，IHC 3+/IHC 2+ ISH-p的患者PFS为25.1个月，ORR为79.7%，而IHC 1/IHC 2 ISH-n的患者PFS为9.9个月，ORR为52.3%；不过目前TROP2被批准用于转移性TNBC而无论TROP2的表达水平，同时目前也没有通用的TROP2表达水平标准，不过这也是由于TNBC目前缺乏药物所至，30%的ORR足够获批导致没有动力再去筛选患者进一步提高ORR。因此靶点的低表达或表达下调可能是患者原发耐药的主要原因。
与TKi小分子耐药机制不同，对ADC的获得性耐药似乎更加复杂和多因素，ADC获得性耐药机制可分为三个主要机制类别：抗原表达下调；改变细胞内运输途径；对毒素产生抗性，主要是通过ABC转运蛋白的上调。例如长期暴露于T-DM1的乳腺癌细胞系会下调HER2的表达，降低溶酶体酸化并减缓蛋白水解，并上调ABCB1(MDR1)和ABCC1(MRP1)药物外排泵。这些变化将分别导致ADC结合减少、抗体水解和毒素释放减少以及增加进入细胞的毒素排出。长期以来，人们都知道MDR1、MRP1和BCRP等ABC转运蛋白在化疗药物（包括蒽环类药物、紫杉醇类药物和喜树碱类药物）的细胞排出中发挥着重要作用。值得注意的是，某些常见的ADC有效负载，例如MMAE、DM1和ozogamicin，也是已知的ABC转运蛋白底物，特别容易受到这种耐药机制的影响。而其他的一些ADC毒素受到ABC转运蛋白的影响比较下，例如dxd等，这也是为什么在T-DM1耐药的患者中T-DXD依旧有效的原因。
如何挖掘ADC的潜力
经过数十年的努力和试错目前ADC的研究方向集中在靶向肿瘤相关抗原，连接子为可裂解连接子，毒素为微管毒素或者DNA损伤剂等。通过在体外或异种移植模型中进行小规模药物筛选，通过给定的肿瘤类型确定ADC每个组成元件。这个过程通常聚焦在单个抗体偶联不同linker-payload的比较，这是比较合理的策略，但是通常会忽略对抗体的选择。这可能会带来严重的后果，因为针对同一抗原的不同抗体可能具有不同的结合特性、配体阻断、通路抑制或者靶标内化等，从而带来不同的体内外活性。有时通过修改临床上单抗进行ADC开发可能并不是一个最优选择，因为ADC的内化和胞内运输对ADC的活性至关重要，其他抗体开发的时候可能并不会考虑到这点。
无论表达水平如何，突变蛋白比野生型蛋白更容易泛素化、内化或循环速率更高，这反过来会影响ADC临床反应。可以设想构建ADC特异性针对含有致癌驱动突变的蛋白（例如EGFR的某些突变形式），这可能将肿瘤特异性最大化到迄今为止只有高选择性小分子酪氨酸激酶抑制剂才能实现的程度。双特异性抗体的出现为ADC创新提供了更多机会，可以通过构建双特异性抗体提高肿瘤的识别或者提高ADC的内化速度等，当然对靶点的亲和能力需要进行合理设计以避免“on-target, off-tumour”，而且对双抗ADC来说毒素的选择也需要仔细斟酌。也有通过肿瘤微环境释放来提高肿瘤杀伤，这方法被证明对实体瘤有效，尤其是那些具有致密基质成分的实体瘤，不过这对连接子筛选的要求比较高，否则很容易在外周释放造成系统毒性。ADC有效负载的创新也存在大量机会，从细胞毒性药物转向根据其抗肿瘤活性选择的靶向或免疫治疗药物，例如BCL-XL抑制剂、Toll样受体激动剂、STING激动剂、核素以及寡核苷酸等。
ADC临床策略
除了药物设计和临床前研究之外，临床和转化研究人员需要考虑设计临床试验来探索ADC的真正临床潜力。包括：（1）确定那些最有可能从ADC治疗中受益的患者（并避免其他患者遭受不必要的毒性）； (2) 研究可能与ADC协同作用以增强其临床疗效。当生物标志物应用于临床试验中选择接受这些药物治疗的患者时，IHC是用于测量靶蛋白表达的主要方式，然而IHC充其量只是一种半定量测定，用来定义阳性表达的cut-off值也是五花八门。正如前所讨论的，除了表达水平靶点的其他特性如循环速度、肿瘤驱动特性、表达异质性和正常组织中的表达等特性包括TME的特征都可能影响ADC的治疗窗和功效。此外，与其他疗法的组合来增强ADC活性也已经得到证明，例如与靶向药物、抗血管生成药物以及免疫疗法等，尤其是免疫疗法支持该策略的基础是ADC介导的免疫原性细胞死亡诱导并募集淋巴细胞浸润肿瘤，这可能促进免疫效应细胞对免疫“冷”肿瘤的识别从而增强ADC活性。
值得注意的是，所有组合疗法都有可能使患者遭受额外的毒性，因此临床的组合疗法需要尽可能地基于临床前数据。简单地组合两种独立有效的药物可能不会产生协同作用，相反可能会缩小两种药物的治疗窗口从而影响治疗效果。
结论
经过数十年的发展，已经开发出多种药物为医生带来更多选择其中一些药物甚至改变了癌症治疗格局，相信随着对ADC活性机制的理解不断加深，未来仍会有重量级的ADC药物进入临床，为患者带来更长的生存期。
参考文献
- Unlocking the potential of antibodydrug conjugates for cancer therapy
