ADC的穿透能力

抗体的组织穿透能力差是实体瘤治疗的一个瓶颈所在，抗原的广泛表达会限制抗体的分布，当抗体穿过渗透出血管壁后很快就结合到血管附近的细胞上很难进一步穿透。

背景

抗体在血管壁附近的肿瘤间隙处聚集，这看上去很像有一道无形的墙阻碍了抗体向肿瘤的进一步穿透这种现象被称为“binding site barrier(BSB)”。在三十几年前研究人员发现了这一现象，并分析了其中的原因抗体向肿瘤部位的穿透能力需要考虑以下几点：渗透出毛细血管、穿过肿瘤的组织间隙以及抗体-抗原的相互作用。根据以上的分析有人通过模型描述了这一现象：1）抗体-抗原的结合能力会阻碍抗体的渗透能力；2）高亲和力会降低抗体渗透能力因为自由的抗体数较少；3）肿瘤中的抗体浓度跟亲和力并不是线性关系；4）提高抗体使用剂量可以提高渗透进肿瘤的抗体，并且分布更均一。

对ADC来说，因为毒性payload的原因，很难通过提高剂量来增加肿瘤分布。最大化抗体的穿透能力以及治疗效果是ADC领域重要的方向之一。通过对ADC的历史研究我们可以发现早期的ADC都在血液瘤中获批，其后才是实体瘤。而且目前的趋势是低毒性的payload，低毒型的payload客观上提高了给药的剂量，这也经过了一段时间的探索才到目前DXD和SN38毒性适中的payload。

抗体穿透性的影响因素

作为ADC来说抗体才是主要组成，因此了解影响抗体穿透因素才能有针对性的进行改造。

1.亲和力对抗体穿透能力的影响

使用来自同一抗体的不同亲和力突变体进行了比较了它们的肿瘤穿透以及代谢能力。这边需要说明的是作者主要比较了相同表位的不同抗体的肿瘤穿透以及代谢水平的差异，如果比较不同的表位会使得情况更加复杂导致结果出现一些偏差难以分析。以下是亲和力的数据。

结果表明相比低亲和力的抗体，高亲和力抗体显示出较少的肿瘤积累。在肿瘤中H3B1在肿瘤中分布最低，亲和力适中的抗体C6.6在肿瘤中分布最多。

使用IHC染色，发现不同抗体从血管向肿瘤穿透能力的差异，其中亲和力最低的G98A显示出最优的肿瘤穿透能力(84.8um)，C6.5穿透的距离为59.7um，ML39、H3B1以及tratuzumab的穿透距离分别为23.3um、20.4um和37.2um。这结果说明抗体的穿透能力与抗体的亲和力成反比。其中tratuzumab的kD为0.09nM，但是与其他抗体的表位不一致，说明表位可能也有一定因素？

抗原介导的抗体内化是抗体降解的一个因素，在0-24小时研究不同抗体在亚细胞水平的分布，G98A结合到细胞膜上的抗体量低于其他抗体；大约80%的G98A未结合细胞，其次是C6.5大约20%的抗体未结合细胞；细胞内的抗体量都比较低，其中G98A最低；细胞内发生降解的抗体量最高的为tratuzumab其次为H3B1、ML39、C6.5和G98A，除了G98A其余抗体的降解都随时间而增加。抗体的解离速率常数(koff)与降解的抗体量之间的关系显示随着抗体koff的降低抗体的降解增加，直至达到一个平台，此时抗体的降解不在与koff相关。HER2蛋白在细胞膜上处于一个动态循环的过程，据报道HER2的内化速率(ke)范围大致在1.6x10-3到1.6x10-4之间，以上的数据说明HER2的ke与抗体的koff可能是决定抗体降解速度的主要因素。当koff快于ke时，随着koff减小抗体降解加快，当koff慢于ke时，抗体的降解与亲和力关系不大，并完全依赖于抗原的内化。

2.母抗体与ADC联合使用增强ADC的穿透能力

作者通过体内实验以及PK/PD模型模拟母抗和ADC联用。实验使用了来源trastuzumab的两个不同ADC(T-DM1和T-vc-MMAE)，同时比较了它们在高表达HER2(N87)和低表达HER2(MDA-MB-453)的肿瘤模型中的作用。实验发现联合用药可以提高ADC的效果，下图解释了其中的原理，母抗和ADC联合用药可以克服ADC的BSB，ADC单用时ADC主要分布在血管周围，具有bystander effect的ADC才有更好的抑瘤作用，联用时母抗可以跟ADC竞争结合HER2，使ADC分布更广，从而提高ADC的杀伤范围。

3.短暂阻断抗体的结合活性提高ADC的穿透能力

前面时通过母抗与ADC竞争结合抗原从而增加ADC的肿瘤穿透，而阻断抗体抗体与抗原的结合会发生什么呢？

这篇文章作用使用了一个trastuzumab的抗抗体(1HE)来阻断抗体与HER2的结合，抗抗体为不含恒定区的纳米抗体，同时(trastuzumab/T-DM1+1HE)给药并不会影响trastuzumab以及T-DM1(左图浅色)的PK(实线为单独给药，虚线为同时给药)，1HE单独给药时则很快被清除掉(右图)。

1HE和trastuzumab同时给药后trastuzumab在肿瘤中的分布更广，trastuzumab单独给药时主要分布在血管附近。下图绿色为抗体，红色为血管

对于T-DM1与1HE同时给药则能增加T-DM1的抑瘤作用。

作者认为通过抗抗体与抗体的同时使用可以跟抗原竞争结合抗原，使抗体更容易在肿瘤中扩散，随着抗抗体的解离，抗体又能恢复与抗原的结合。

4.游离抗原可以提高ADC的穿透能力

许多的肿瘤标记物都会从肿瘤细胞上脱落下来，例如CA125、HER2、PSA、mesothelin以及CEA等等。这些脱落的抗原被认为会影响相关抗体的应用，然而这种主观上的认识并没有相关的理论支持。虽然一些体外的实验证实，使用一些抑制剂阻止抗原的脱落确实会增加抗体进入细胞的量，但是在其后的研究发现在实体瘤中这些脱落的抗原扮演促进抗体穿透的角色。这主要是因为这些脱落的抗原可逆的结合到ADC上，客观上起到了保护作用使抗体更容易穿过BSB。

作者通过实验建立了一个数学模型，来模拟免疫毒素(RIT)从血管向肿瘤穿透的过程，并且将游离的抗原纳入计算。下图为模型的示意图。

根据模型的预测结果，穿过血管进入EVS的抗体约为抗体总量的0.4%-0.6%，在首次用药20min后，大约87%进入EVS的RIT结合到细胞表面抗原，8.5%结合到游离的抗原，3.6%进入肿瘤细胞其中有2.3%被降解；4小时后进入EVS的RIT达到最大量，此时并无新的RIT进入EVS，此时进入EVS的抗体中38%被降解(32%被肿瘤细胞降解)，结合到游离抗原的比例为27%结合到膜表面的比例为28%，肿瘤中的完整RIT比例为1.6%；1天后，93%的抗体被降解(77%被肿瘤细胞降解)，肿瘤中完整的RIT比例依旧为1.6%。直至第三次用药，预测的变化基本与之前一致，除了降解的总量更高。

将模型的参数经过稍微修改，得到另外两个模型，1）抗原脱落，但是抗体-游离抗原不发生解离，2）抗原不脱落。根据模拟结果当抗原不发生脱落时的抑瘤效果为蓝色虚线；当抗体-游离抗原不解离时游离抗原的产生将会影响RIT的抑瘤效果(红线)；而当抗原发生脱落且处于结合-解离动态平衡时游离的抗原反而会增加RIT的抑瘤效果(蓝线)。

这其中可能的机制是，当抗原不发生脱落时RIT跨过血管壁后很快结合到血管附近的细胞上，杀伤范围比较窄，很难降低肿瘤中细胞密度(下图A虚线，B右侧)；而当抗原发生脱落时，游离的抗原阻止跨过血管壁的抗体结合到附近的细胞，抗体更容易穿透到远离血管的部位，而当游离的抗原发生解离时抗体可以跟细胞膜表面的抗原发生结合从而对肿瘤进行杀伤，因此杀伤的范围更广，可以很快降低肿瘤中的细胞密度(下图A实线，B左侧)。

总结：

随着ADC成为治疗实体肿瘤的热门方向，很多的难题也摆在大家前面，除了linker和payload的组合以外，抗体工程方向能做的也很多，例如增加ADC的组织穿透性、内化速度、定点偶联位点的选择、抗体亲水性改造、进一步降低免疫原性等等。

参考文献：

1. A modeling analysis of monoclonal antibody percolation through tumors: a binding-site barrier

2. Influence of Affinity and Antigen Internalization on the Uptake and Penetration of Anti-HER2 Antibodies in Solid Tumors

3. Antibody Coadministration as a Strategy to Overcome Binding-Site Barrier for ADCs: a Quantitative Investigation

4. Transient Competitive Inhibition Bypasses the Binding Site Barrier to Improve Tumor Penetration of Trastuzumab and Enhance T-DM1 Efficacy

5. Antigen shedding may improve efficiencies for delivery of antibody-based anticancer agents in solid tumors

6. Design of high avidity and low affinity antibodies for in situ control of antibody drug conjugate targeting