CD19-CD28双抗为glofitamab提供了有效且安全的共刺激信号
今天分享的是罗氏的一篇文献，介绍的是CD19-CD28双特异性抗体，这项研究说明CD28可以为T细胞提供效且安全的共刺激信号并且提供了大量的证据支持将共刺激信号加入TCE治疗策略可以有效增强TCE的抗肿瘤效果。
T细胞的激活需要TCR复合物的第一信号也需要共刺激受体提供的第二信号。目前基于CD3的双特异性抗体(TCE)在血液流大放异彩，例如glofitamab目前已经被获批治疗r/r DLBCL。不过CD28的开发则缓慢的多，因为在开发第一款CD28激动剂(TGN1412)的时候6名健康受试者均出现了致命的全身炎症反应，此次临床试验导致后续开发抗体激动剂时都比较的谨慎。目前管线中有CD28的双抗的公司不多，除了今天的主角罗氏之外，再生元也是开发的主力。
去年他们披露的临床进展中一款PSMA-CD28双抗(REGN5678)与PD-1抗体联用的队列中出现了患者死亡并停止入组，不过他们并没有终止REGN5678或者其他CD28双抗的开发，可以预见的是他们对CD28双抗的开发是激进且谨慎。
罗氏的CD28双抗目前主要集中在血液瘤中，尽管glofitamab的表现出优异的单药疗效，但是额外提供共刺激信号可能会进一步增强T细胞的活性引起更强更持久的肿瘤杀伤。基于此他们又开发了数款共刺激双特异性抗体一款为Englumafusp alfa(CD19-41BBL，RG6076)，另一款为CD19-CD28双特异性抗体(RG6333)，通过向T细胞提供共刺激信号来增强glofitamab或者其他TCE的杀伤。
CD28抗体改造以及双特异性抗体设计
CD28抗体来源于TGN1412(5.11A)，通过对抗体序列的优化提高了稳定性，获得三个不同亲和力的CD28抗体CD28LOW kd=36nM、CD28MED kd=10nM、CD28HIGH kd=1nM，为了安全性的考量双抗的结构为1:1，同时消除了Fc的效应功能(a)，双抗都能与CD28细胞系结合(b)，激活IL2报告基因依赖于CD19的表达(c)。
接下来在人源化NSG小鼠中检测了非靶向的CD28抗体分布，CD28HIGH主要集中在血液和脾脏，中低亲和力的CD28双抗则较少在外周分布，这点也与CD3的情况类似。
在皮下接种NALM-6淋巴瘤的人源化NSG小鼠模型中，联合glofitamab，CD28LOW表现出比CD29MED更强的的抑瘤作用(H)，而且肿瘤浸润的CD8T细胞也更多(I)。
CD19-CD28的活性依赖第一信号
因为CD28抗体来源于超激动剂TGN1412，所以比较了CD19-CD28和TGN1412诱导细胞因子以及激活免疫细胞。在体外，只有TGN1412可以触发浓度依赖的因子分泌(a)，
在人源化NSG小鼠中TGN1412无论使用人IgG4还是小鼠IgG1恒定区都可以诱导强烈的因子分泌，在4小时达到顶峰，但CD19-CD28未检测到因子分泌(B、C)。
仅单与Glofitamab联合使用时，CD19-CD28可以诱导人PBMC中T细胞活化标记物和促炎细胞因子呈剂量依赖性的上调。
以上结果说明CD19-CD28并不是一个超激动剂，对T细胞的激活依赖于第一信号，且对T细胞的激动与CD19的表达水平相关。
在体内CD19-CD28以剂量依赖性方式增强Glofitamab的活性
在接种WSU-DLCL2-Fluc的人源化小鼠模型中，CD19-CD28与Glofitamab联用使肿瘤完全消退(b)，到day17后疗效显著优于Glofitamab单药(c)，到day10接受对照以及CD19-CD28的动物因为肿瘤进展导致体重下降(d)，Glofitamab单药组以及联用组的小鼠一开始就发生体重下降，这是因为TCE的作用模式以及因子释放导致，这些小鼠随着肿瘤的清除体重一直保持稳定(d)。
在同样的小鼠模型中作者也发现了CD19-CD28的活性具有“钟型”曲线，根据观测的数据以及建模分析，提出了最佳剂量范围。并根据huFcRn转基因小鼠中的PK数据预测患者中的数据，根据临床观察的结果与预测的数据一致良好，这也为从人源化小鼠中获得的临床前结果预测人体PK与药效的匹配程度提供了证据。
接下来在患者来源的T细胞对CD19-CD28的响应，发现只有与Glofitamab联用会增强granzyme B和IFNγ释放，而单药并不会引起因子释放。
CD19-CD28增加肿瘤中的促炎性T细胞特征并促进跨内皮迁移
在小鼠模型中CD19-CD28与Glofitamab联用可以增加T细胞浸润，同时CD8/Treg的比例也会上升，这说明联用可以优化肿瘤中的炎症表型。另外联用组也能增加CD28 T细胞肿瘤浸润，并且增加肿瘤中T细胞特征和IFNγ通路基因的表达(b)。
Glofitamab诱导肿瘤中ICAM1表达，但与CD19-CD28联用使ICAM1表达向内皮细胞倾斜，表明CD19-CD28可能促进T细胞跨内皮迁移。
这些发现表明，CD19-CD28在早期阶段增加肿瘤T细胞浸润和促炎细胞因子谱，并在后续阶段促进细胞毒性T细胞特征，从而增强glofitamab的抗肿瘤功效。
glofitamab与CD19-CD28和CD19-4-1BBL联用在体内表现出更强更持久的抗肿瘤效果
加下来研究了glofitamab与CD19-CD28和CD19-4-1BBL二联或者三联的效果。glofitamab和CD19-CD28联用诱导PBMC中T细胞表达4-1BB，这说明CD19-CD28可能会增强T细胞对CD19-4-1BBL的响应。
三药的组合可以诱导DLBL患者T细胞表达高水平的granzyme B、IFNγ、IL-8和IL-2。
在OCI-Ly18肿瘤模型中，glofitamab与CD19-CD28或/和CD19-4-1BBL联合治疗显示出比glofitamab单药更长的抗肿瘤活性，双药组合只会使大多数动物的肿瘤生长延迟(d)，而三药组合则展示出长期的肿瘤抑制(e)。尤其是在先用glofitamab和 CD19-CD28然后用glofitamab和CD19-4-1BBL 治疗的动物中尤其明显(e)，这也说明在TCE治疗中增加共刺激信号的顺序尤为重要。
人源化小鼠模型中探索安全性和剂量评估
前面提到在开发TGN1412时发生了致命的因子风暴，但是在临床前的非人灵长类动物中并未发现安全性风险，后续的研究发现食蟹猴T细胞上的CD28表达水平不一致。因此在食蟹猴中评估这边的CD19-CD28双抗安全性可靠程度有待考量，作者在体外使用食蟹猴的T细胞进行研究，发现与人T细胞不同食蟹猴的T细胞对Glofitamab与CD19-CD28的联合刺激都没有反应，这也说明食蟹猴并不是合适的动物。
不过从人源化NSG小鼠脾脏中分离的T细胞对CD19-CD28和Glofitamab组合的反应与人T细胞相当，因此人源化小鼠可以作为人类剂量预测的合适模型。
之前Glofitamab的临床前实验使用Gpt预处理可以减低Glofitamab引起的因子风暴，此处实验设计的时候也沿用了同样的思路，除了Glofitamab和CD19-CD28单药之外，还设置了4个不同的联用组：1）combo sim (Glofitamab和CD19-CD28同时用药)，2）combo seq (先使用Glofitamab 72小时后再用CD19-CD28)，3）Gpt+combo sim (用药7天前先使用Gpt，然后同时Glofitamab和CD19-CD28同时用药)，4）Gpt+combo seq (用药7天前先使用Gpt，然后使用Glofitamab 再过72小时后再用CD19-CD28)。
结果显示，在4小时的时候一开始就使用Glofitamab的组别(Glofitamab单药组以及combo sim组)因子释放都比较高，Gpt+combo sim组的因子也有略微的上升；
从小鼠的体重下降的趋势看Glofitamab单药组、combo sim组、Gpt+combo sim以及combo seq都发生了体重的下降，而Gpt+combo seq的体重与对照组和CD19-CD28单药组一致都没有太大变化，从T细胞的激活maker看基本也是一致的趋势。
这些发现进一步指导了正在进行的glofitamab与CD19-CD28联合治疗r/r NHL的1期临床试验设计。Gpt、glofitamab step-up给药以及一周后连续给药CD19-CD28，同时测量细胞因子的释放水平，结果显示使用这种方案减轻了全身细胞因子的释放。
讨论
本研究介绍了 CD19-CD28，这是一种靶向CD28的双特异性抗体，可为T细胞提供有效且安全的共刺激信号，可以与glofitamab以及其他共刺激抗体联用用于血液恶性肿瘤的免疫治疗。本文先从设计上降低CD28的亲和力来避免CD28结合到外周的T细胞，同时为了避免CD28的非特异性激活作者还消除了抗体的Fc效应功能；考虑到人猴CD28表达谱的差异，难以在猴子体内进行安全性评估，不过人源化NSG小鼠可以作为合适的模型，在小鼠模型中可以同时评估双抗的有效性和安全性，发现CD28双抗可以增强glofitamab的抗肿瘤作用，并且具有一定的安全性；为了进一步减少共刺激信号带来的因子风暴风险对联用方案的开发也进行了探索，在结合小鼠模型和huFcRn转基因小鼠中的PK数据预测人体剂量被证明对CD19-CD28是准确的，在1期临床试验中没有发生细胞因子风暴。
参考文献
- CD19-CD28: An affinity-optimized CD28 agonist for combination with glofitamab (CD20-TCB) as off-the-shelf immunotherapy
