CrossMab的开发

双特异性抗体
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knobs-into-holes（KIH）可以解决双特异性抗体重链异源二聚的问题，但是如果想构建一个结构与单抗类似的双抗还得解决两条轻链与重链之间配对的问题。

下图展示了可能的产物A为正确配对，BCD为副产物。

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其实genetech在研发KIH的时候已经给出了一个答案–共同轻链，但是共轻链的来源比较窄噬菌体文库、已有抗体轻链改造、转基因小鼠等（除了共轻链还有Orthogonal、二硫键再设计、FAST-Ig、ScFv、VHH等等），不是所有公司都有这个能力，今天介绍的一个平台CrossMab就是解决这个问题的。

设计

上图中的错配原因主要是VH/VL以及CH1/CL之间交界面间结构配对且无特异性所致，因此如果可以将重链以及轻链上的domain互换位置，那么就可能导致交叉后的链与未修改的链之间无法形成配对。

根据这种想法使用KIH保证重链之间的异源二聚，然后将B图的heavy chain 2与light chain 1的domain互换位置，设计出C、D、E图三种不同的方案，C为VH-CH1与VL-CL互换位置，D为VH与VL互换位置，E为CH1与CL互换位置。

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可以如此替换的原因是：

  1. 直接将VH-CH1与VL-CL替换，对Fab的影响不大，只是将与Fc相连的位置从CH1换成了CL末端的C。

  2. 后两个单domain的替换也是如此，VH/VL以及CH1/CL之间虽然序列有所差异，但是结构相似度高且很容易叠合，因此替换相互的位置并不会对抗体产生影响。

不过从结果看来三种方法得到的终产物比例依旧有所区别。

CrossMabFab（E）会形成没有功能的重链二聚体以及无功能的Fab（F、G）；CrossMabVH-VL（H）会形成共轻链的错配，因为轻链可变区之间依旧有形成本周蛋白的倾向，而且CH1和CL之间的相互作用会进一步增加这种可能性（I）；只有CrossMabCH1-CL才能形成无副产物的双抗（J）。

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案例

为了验证这个技术的可行性，构建了VEGF-A x Ang-2双抗。

VEGF-A：bevacizumab（IgG1，kappa）

Ang-2：LC06（IgG1，kappa）

重链使用KIH技术，LC06 重链使用knob （T366W），bevacizumab 重链使用hole（T366S，L368A，Y407V），分别在knob和hole上引入半胱氨酸（S354C）&（Y349C）稳定结构。

一步纯化后的数据（图A、B），感觉常规的SEC和PAGE无法区分上图中CrossMabVH-VL的I副产物呢，补充材料中的质谱结果也没看明白，据文章说是通过分子筛来做的二步纯化，更看不懂了。。。反正后面也做了夹心，都能结合。

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下图是他们通过质谱给出的副产物示意图。

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然后做了Ang-2–VEGF CrossMabCH1-CL的小鼠体内抑瘤实验，这个抗体就是后来的vanucizumab，临床上耐受性较好、疗效也有免疫原性也比较低，只是与贝伐的比较中没有显著的优势，然后就嘎了。

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做成类似单抗的双抗只是KIH跟CrossMab的一种用法，基于这两技术的配合可以组合成各种不同的双抗类型，Roche也做了各种不同结构双抗的探索。

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不过Roche这么多年以来在开发了十几种基于CrossMab的抗体药物进入临床，目前已经上市的包括Faricimab和Glofitamab。其中也有岸迈的三个双抗也同样利用了类似的原理，目前这三款正在临床试验，不过根据一些crossmab的文献，估计属于副产物很多的情况，不晓得它们的CMC如何。

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讨论

双特异性抗体开发了这么多年，各种“**-Ig”满天飞，其实到头来经过临床验证能够上市的平台技术也就这么几个。CrossMab和KIH技术是一种通用的相对简单的双特异性抗体构建方案，理论上任意的两个抗体都能在短时间内使用这两个技术糅合成双特异性抗体，不像一些其他平台得“case by case”。Roche也在CrossMab基础上又进一步进行了修改增加了电荷配对，进一步减低错配的比例，使得KIH和CrossMab老而弥坚。

参考文献

  1. Immunoglobulin domain crossover as a generic approach for the production of bispecific IgG antibodies

  2. 2.The use of CrossMAb technology for the generation of bi- and multispecific antibodies

  3. Ten years in the making: application of CrossMab technology for the development of therapeutic bispecific antibodies and antibody fusion proteins

  4. engineering therapeutic bispecific antibodies using CrossMab technology

  5. Variable heavy–variable light domain and Fab-arm CrossMabs with charged residue exchanges to enforce correct light chain assembly