恒定区亚型对IgG抗体可开发性的影响
生物治疗领域的药物大部分是IgG的单抗，主要使用的IgG亚型主要包括：IgG1、IgG2和IgG4以及它们的衍生突变。这篇文章作者将3个不相关的抗体可变区序列，分别都构建到IgG1、IgG1EN、IgG2 和IgG4PAA，共得到12个抗体，并检测了恒定区对于抗体的可开发性和高浓度稳定性。
介绍
在获批上市的生物制品中，大部分属于单抗克隆抗体制剂。IgG是多结构域且具有糖基化的异源二聚体，由两条轻链和两条重链通过数对链间二硫键组成，重链和轻链都由可变区和恒定区组成。尽管IgG的序列有较高的同源性，但是它们之间仍有一些明显的区别：抗体恒定区序列的差异、铰链区的长度、重链间的二硫键个数、重轻链间的二硫键位置等等。IgG1和IgG4的铰链区含有两对重链间二硫键、IgG2含有4对重链间二硫键。这些变化影响了IgG跟FcγR的结合从而导致了不同的效应功能，比如ADCC、ADCP和CDC等等。这些效应功能是筛选抗体药物的主要考虑因素，同时也激发了许多Fc工程工作，以优化所需的FcγR相互作用或效应功能。
近年来在时间压力和生产生本控制的驱动下，大家意识到IgG亚型的选择可以在改善抗体的化学、制造和控制(CMC)特性以及优化适合治疗应用的生物活性等方面发挥关键作用。选择合适的IgG亚型可以加快抗体的产品开发流程。单抗的生产是一个复杂且昂贵的流程，首先需要专门的单克隆细胞进行优化培养、然后通过高效的下游纯化工艺收获抗体去除杂质，最后使用严格监管的产品生产指南来生产适合人类使用的药物。生产产品的保质期一般需要在2-3年以保证稳定的产品质量和可靠地为患者提供充足的供应。生物疗法针对的许多疾病都是慢性病，经常需要相对较高的单抗浓度和皮下给药以获得最佳疗效和更好的患者依从性。这些要求对液体制剂提出了严格的要求，因此对候选药物的良好分子稳定性提出了很高的评价。所以细胞培养过程的表达量、杂质去除效率以及高浓度下的长期稳定性成为治疗性单抗生产的关键成功因素。可以根据不同IgG亚型的特征来优化单抗的表达量和稳定性并促进药物的开发。
关于IgG亚型对抗体的特性的影响一直有一些报告，如酸性条件下的聚集倾向已经被充分的研究，在低pH病毒灭活期间IgG2和IgG4 单抗比IgG1 单抗更容易聚集；IgG1 单抗更容易发生片段化，而IgG4 单抗可能更容易聚集；Alekseychyk et al. 使用高通量制剂筛选研究了同样可变区的IgG1和IgG2抗体，他们发现IgG1的稳定性整体优于IgG2的稳定性； Tian et al.系统的比较了IgG1、IgG2和IgG4亚型在不同pH下的稳定性，在高于pH的条件下抗体的聚集程度是IgG1 < IgG2 < IgG4而抗体片段化的倾向为IgG1 > IgG2 > IgG4；Neergaard et al.研究发现IgG1和IgG4也影响了抗体在高浓度下的表现；Levy et al.分析了Protein A纯化后的残留HCP，他们发现可变区序列和恒定区序列对于HCP的残留量以及种类都有影响。
这篇文章作者平行对比了IgG1、IgG1EN、 IgG2 和 IgG4PAA，比较了它们对抗体开发特性的影响包括：产量、残留HCP、Fc糖基化、加速稳定性以及长期稳定性等。这些发现揭示了每个IgG亚型的共同和独特的分子属性，以及这些属性对于单抗作为医药产品的开发的影响。
结果
这篇研究的抗体来自于三个抗体(Fv-A, Fv-B, and Fv-C)分别构建进IgG1、IgG1EN、 IgG2 和 IgG4PAA。这12个抗体分别构建了稳转细胞系并在1L的药瓶中进行表达。FV-A的表达量最高；同时三个不同抗体在IgG1中的表达量也是最高在IgG2中的表达量最差；经过二步纯化后IgG4PAA的HCP残留水平最高，IgG2的残留低于IgG1跟IgG1EN，同时HCP的残留也与抗体的可变区相关；Fv-C的纯度为三个抗体最差的，无论换成什么恒定区；IgG2-A在CEX的时候发生了沉淀，因此没有做后续的分析。
见下表：
抗体的糖型：
抗体的糖型都比较的一致，其中IgG4亚型的G0F含量最高，IgG2和IgG4的G1F含量相对较低，跟IgG1相比IgG1EN的G1F增加了6-10%，G2F的含量增加了2%，G0的量降低了2%。
见下表：
稳定性：
除了IgG2-A，其余样品在相同的浓度和制剂中，在5°C、25°C和 35°C条件下放置1个月到30个月评价了它们的理化稳定性
外观方面，IgG2跟IgG4PAA表现出更多的乳光色，虽然可变区对于抗体浊度的影响也有一定影响，但是同样的抗体IgG的亚型影响更大。
抗体的聚集变化在这个实验中并不是很明显，但是在25°C的条件下放置的时间越长聚集会有所增加。
抗体片段化可以明显的看到IgG1和IgG1EN的片段化多于IgG2和IgG4PAA，随着时间增加或者温度的升高而增加。
电荷异构体的变化，大部分抗体随着放样的时间增加或者温度的上升酸峰都会持续增加，其中IgG1EN在25°C放置1个月时最为明显，但随着时间的持续或这温度的上升酸峰差异会有所减少。碱性峰的增加主要为IgG4PAA，中间有增加再减少的趋势，可能是酸峰的增加覆盖了碱峰的成分？不同抗体之间的趋势基本一致但又有例外，从之前获取的一些信息显示抗体的恒定区也是酸碱峰变化的主要来源之一，这里很难去评估究竟是恒定区的原因还是可变区的影响。
翻译后修饰，可变区的翻译后修饰跟抗体序列的相关性很大，一些抗体可变区在不同的恒定区上表现出一样的翻译后修饰。因此这边研究了5°C放置30个月和 25°C放置3个月的抗体Fc区域的PTM变化。研究的位点为N315、N325、N361、N384、N389和 N434 (EU number)从下图可以看出25°C放置3个月的脱酰胺明显多于5°C放置30个月；IgG1EN明显多于IgG1这可能与突变相关；5°C放置30个月IgG1的稳定性高于IgG1EN、IgG2和IgG4PAA，25°C放置3个月时IgG1EN < IgG1 < IgG2 = IgG4PAA。从位点上看稳定性N325 < N315 < N384 < …
除了脱酰胺，这些Fc在不同的位点也发生了氧化，Trp和His发生氧化的水平比较低，发生氧化比较多的位置位于Met。
其他的PTM包括异构化也有检测到，但是发生的水平比较低。
总结
与相应的IgG2和IgG4PAA单克隆抗体相比，IgG1和IgG1EN单克隆抗体的表达水平平均增加约30%，但是可变区的序列也对抗体的表达水平有较大的影响。
IgG4PAA mAb的残留HCP水平相对较高，而IgG2 mAb的残留HCP明显较低，可变区域对残留HCP的影响也是显而易见的，因为与Fv-B和Fv-C系列中的亚类对应物相比，Fv-A 抗体具有更高的HCP水平。
IgG4PAA单克隆抗体往往具有较高的G0F水平，而IgG1和IgG1EN单克隆抗体在每个系列中表现出相对较高的G1F水平，不同抗体之间都有类似的趋势，显示这可能不受抗体可变区的影响。
与IgG1和IgG1EN单克隆抗体相比，IgG4PAA和IgG2亚类的所有mAb均表现出更高水平的乳光色，这并未导致样品中蛋白质含量的显着损失，一般这是由电荷相互作用或疏水性或两者同时的自缔合所驱动。
在这项研究中，抗体的聚集变化没有明显的IgG亚类依赖性差异或增长趋势。
在5°C下放置30个月后，与IgG2和IgG4PAA单克隆抗体相比，IgG1和IgG1EN单克隆抗体的片段化显著增加。有趣的是，低温下IgG亚型之间的片段化不一定反映在短期研究中，因为Fv-A和Fv-C系列在25°C或35°C下的1个月稳定性数据显示IgG亚类之间仅存在微小差异，提示这些mAb的片段化机制存在温度依赖性差异。
文章发现，在所有三个系列中，在孵育1个月35°C或3个月25°C后，与IgG1和IgG2mAb相比，IgG1EN和IgG4PAA单克隆抗体主峰更容易减少。IgG亚型对每个系列抗体酸性或碱性电荷异构体的形成缺乏一致的影响，这可能反映了可变区域中的许多残基也受到修饰的影响。
六个潜在脱酰胺热点中的三个N325、N384和N389，几乎占了Fc域中所有的总脱酰胺变化。发现CH2结构域内的N325是所有IgG分子脱酰胺的主要位，有文献显示N325脱酰胺会影响ADCC活性。虽然IgG1抗体和IgG1EN抗体的脱酰胺变化在多个位点基本相当，但每个系列的IgG1EN抗体中N325处的脱酰胺加剧，可能导致该IgG1变体的酸性峰大幅增加，而且这个位点在突变的位点旁边，提示对通过突变消除IgG1的效应功可能会增加这个位点的脱酰胺修饰。
M252在所有Fc结构域中都很常见，被确定为所有样品中总氧化水平变化的主要贡献者。对于Fv-A和Fv-B系列，与IgG1 抗体相比，IgG1EN 抗体中M252的氧化水平变化加剧，类似于N325的脱酰胺水平变化，而IgG1-C和IgG1EN-C中的M252氧化水平保持相似。此外，IgG4PAA-B在M252处的变化明显大于IgG4PAA-A或IgG4PAA-C，可能表明存在可变区的结构域影响。
IgG1和IgG1EN单克隆抗体的碎片化风险较高，而IgG1EN单克隆抗体的电荷异构体变化和脱酰胺风险也较高。IgG1和IgG1EN单克隆抗体的浊度风险最低，而IgG2和IgG4PAA的风险较高。虽然 IgG4PAA抗体的粘度往往更高，但数据表明可变结构域和 IgG 亚型都有一定的影响。在本文的研究中，所有单克隆抗体（无论IgG亚类如何）均表现出较低的聚集风险。
这篇文章作者平行对比了IgG1、IgG1EN、 IgG2 和 IgG4PAA，比较了它们对抗体开发特性的影响包括：产量、残留HCP、Fc糖基化、加速稳定性以及长期稳定性等。这些发现揭示了每个IgG亚型的共同和独特的分子属性，以及这些属性对于单抗作为医药产品的开发的影响。
参考文献
Impact of IgG subclass on monoclonal antibody developability
