抗体药物临床前免疫原性评价
近期领导对预测抗体免疫原性比较上心，最近看了不少文献同时也用了不少软件来预测抗体免疫原性。今天看刚好看到一篇综述，是欧洲免疫原性平台（EIP）的非临床免疫原性风险评估小组对目前使用的assay以及方法进行了回顾，这篇文章比较系统，对方法介绍的比较详细，就把文章整理了一下。吐槽一句，这哥们写的文章里面到处都是长难句。只能意会难以言传，建议去阅读原文。
治疗性蛋白药物的免疫原性会影响它们在治疗过程中的有效性和安全性。截至目前已经有各种方法被开发出来用于预测药物的免疫原性，包括计算模拟（in silico）、体外实验（in vitro）和体内实验（in vivo），这些方法主要是评估抗体序列以及模拟抗抗体（ADA）生成的各个阶段的免疫学assay。然而因为这些assay的复杂性、免疫学基础科学的不确定性以及不同的使用目的，导致不同的研究者在相似的assay中会获得较大的差异。这些差异可能会影响到最终的结果，比如对候选药物的免疫原性不能给出准确的评价。
介绍
目前工业界对“预测免疫原性性”这一概念的理解是识别治疗性蛋白药物本身的或者潜在的触发患者免疫系统产生ADA反应的风险（表1）。在产生ADA的过程中有一些关键步骤： 1）激活天然免疫细胞比如巨噬细胞和树突状细胞，2）招募T细胞启动获得性免疫反应，3）浆细胞产生抗抗体。治疗性蛋白药物被抗原递呈细胞（APCs）吸收、处理以及递呈是启动这一系列免疫反应最开始以及最重要的一步。APCs是一群异质性的免疫细胞（包括树突状细胞、巨噬细胞和B细胞等），它们可以吸收、处理抗原然后以线性多肽的形式组成MHC II复合物递呈给外周淋巴器官中的初始T淋巴细胞（naive t lymphocytes）。初始T细胞的启动需要三种不同的信号： 1）TCR识别到特异的多肽-MCH II复合物激动第一信号，2）CD80/CD86与T细胞上的CD28相互作用提供T细胞生存和增殖的第二信号使T细胞，3）根据APCs细胞提供的不同细胞因子分化成不同的效应T细胞。例如初始T细胞可以通不同的第三信号(例如DC细胞分泌的细胞因子)分化成完全不同的效应T细胞，比如Th1、Th2、Th9、Th17、滤泡辅助性T细胞、调节T细胞和滤泡调节性T细胞。激动的T细胞会表达不同的表面受体（如：CD25、CD69、CD70、CD71、CD95、HLA-DR-DP-DQ）、共刺激分子（如：CD26、CD27、CD28、CD30、CD40L、CD134）、驱化因子受体（如：CXCR3、CCR5）和粘附分子（如：ICAM-1、LFA-1）这些分子都能调节并直接激活免疫反应，特别是激活初始B细胞，使之分化成分泌抗体的浆细胞。在免疫反应的最终阶段，大部分的抗原特异性T细胞都会衰竭只剩下少部分的记忆T细胞存活。特别是中央记忆型T细胞，它们会定位到二级淋巴器官并保持自我更新及增殖能力，能够在多肽-MHC II复合物的刺激下快速分化成效应T细胞。
除了抗体本身以及潜在的特性会引起免疫原性以外，其他的因素也会应其ADA的产生，包括患者相关的因素（HLA亚型、免疫功能）、治疗过程、药物使用方式、药物的MOA等等。因此阐明以上的每个过程对临床上药物引起免疫反应的作用和机制都需要经过大量、系统的研究。在临床前，开发者可以有数年的时间建立一些模拟部分免疫系统的assay来反应药物在体内激活免疫系统的一些重要免疫反应。然而临床前的研究仅仅是模拟免疫反应，免疫原性风险的评估是可能性和推论的组合，预测结果的置信区间由这些assay背后的科学依据决定。
表1：
| Term | Definition |
|---|---|
| Antigenicity | The ability of a molecule or substance to be specifically recognized by an antigen receptor (T cell receptor – TCR, B cell receptor – BCR or antibody). |
| Immunogenicity | The ability of a molecule or substance to provoke an integrated systemic adaptive immune response to an antigen, involving recognition by specific antibodies and/or T cells. |
| Agretope or MHC binder | Antigen-derived peptide able to bind the major histocompatibility complex molecule (MHC). |
| Promiscuous agretope or MHC binder | Antigen-derived peptide able to bind multiple MHC alleles. |
| T cell epitope | Peptide able to bind MHC class I or II and to trigger CD8+ cytotoxic T lymphocytes or CD4+ T helper cells activation, respectively. |
| Prediction | Forecast of clinical outcome based on in silico, in vitro and/or in vivo findings. |
| Risk assessment | Process of (1) identifying potential negative clinical outcomes, (2) analyzing and evaluating their likelihood and seriousness, and (3) implementing appropriate risk mitigation and control measures. |
| Intrinsic properties | Physical-chemical properties of a molecule or substance that may cause or facilitate an interaction with the immune system. In the concept of a therapeutic protein/peptide, these properties might include:• Amino acid sequence • Glycosylation profile • Affinity for ɣFc Receptors • Affinity for FcRn |
| Extrinsic properties | List of danger signals in therapeutic protein/peptide preparations potentially capable to induce an immune response. There properties might include: • Host cell protein contamination • Misfolded proteins • Degradation fragments • Aggregates • Formulation; excipients • Immune complexes formed with DC-shed soluble targets • Target-mediated internalization |
临床前预测免疫原性的工具以及assay主要还是依据目前对免疫反应的理解（图1），主要可以分为三个部分：1）计算模拟工具，通过预测与HLA的结合能力识别潜在的T细胞表位；2）in vitro assay，记录某些特定的细胞对刺激物的免疫反应；3）in vivo，在动物模型中模拟人源化的免疫反应。所有的临床前免疫原性预测方法面临的最主要的挑战就是MHC II的多态性，现在已经鉴别出人类有超过7300种等位基因。因此，在设计assay的时候需要考虑到MHC II的多样性能够代表主要的人群或者某些特定的亚群。
图1
计算潜在的T细胞表位
在计算机上预测免疫原性的放法主要就是预测一级结构上潜在的T细胞表位，通过将蛋白药物的序列依次划分成9-15个氨基酸的多肽并计算它们与各个HLA分子的结合能力。在发现阶段可以使用这种方法来筛选抗体，然后在优化先导分子的时候通过突变减少T细胞表位，一般药物开发人员会同时使用in vitro assay来验证免疫原性的预测以及优化结果。 这些9-15个氨基酸长度的多肽成为有功能的T细胞表位需要许多前提条件：
- 多肽与HLA有较高的结合能力
- p-HLA复合物的稳定性
- APCs处理蛋白，递呈多肽的过程
- 特异识别p-HLA的CD4 T细胞 因此仅仅计算多肽与HLA的结合能力是不够的，例如由于免疫耐受，一些单克隆抗体的框架区序列可能与HLA结合但是它们可能并不是潜在的表位。其他HLA结合的序列不会成为T细胞表位的原因是这群T细胞在阴性选择的时候已经被清除了，或者亲和力比较低而不能引起免疫反应，其他的机制包括外周耐受等等。
新开发的基于多肽与MHC II结合能力预测T细胞表位的算法已经引用了更多的抗原递呈和复合物稳定性数据，更多的实验数据进一步提高了这些算法的准确性。在一个直接对比研究中MixMHC2pred，MARIA，neonmhc2和NNAlign_MAC都优于现有的预测方法，然而这些研究还是有一些局限，比如它们只预测了一些特定的HLA-DR等位基因、使用了少数的几株细胞来预测T细胞表位，多肽蛋白质组数据较局限等等。研究者必须充分了解计算机算法的设计目的、模型是如何训练的，这样才能准确评估免疫原性风险数据。
In vitro assay
通过体外的细胞实验来模拟免疫细胞对外源刺激的反应，这些assay可以直接或者间接反映人体内部分免疫学过程。尽管在体外模拟体内的免疫环境是比较困难的，一些免疫细胞的特性被开发成assay用来评估治疗性蛋白药物是否包含能够激动记忆T细胞反应的CD4 T细胞表位。现在的体外assay基本都围绕着免疫系统激动的主要流程：
- APCs 活化
- 多肽递呈
- CD4 T细胞活化
- B细胞活化
细胞的获得难易程度、质量、遗传背景、谱系和活化状态都会影响这些assay的结果，所有体外assay面临的最主要难题是MHC II基因多态性，所以这些assay必须使用大量的供体，保证覆盖了大部分人群的HLA。最后药物的MOA（特别是免疫调节功能）和组成（纯度、聚集、辅料组成等）也会影响assay的设计和结果。 目前对于使用小量样本的assay来预测药物的免疫原性并没有一个明确的共识，打脸的是，现在药物开发者都被要求根据用途和治疗人群，为每种药物开发一系列assay来预测免疫原性。
In vivo models
通过计算机和体外assay模拟免疫系统相关部分的复杂性和挑战促使研究人员考虑研究整个免疫系统的体内模型，因为它更适合反应在免疫耐受被破坏时触发ADA产生的过程。正常的模式动物并不适合这类研究，因为人源的治疗性蛋白药物都可能被这些动物识别成外来抗原，所以一些转基因动物被开发出来模拟整个ADA产生过程。但是这些转基因小鼠都存在一些局限，例如HLA转基因小鼠现在只被用来研究具有发生自免疾病风险的等位基因，这些小鼠仍然保持小鼠的MHC等位基因和TCR。
截至目前人源化动物并没有在临床前的免疫原性评估中被广泛使用，使用动物来评价免疫原性的花费和时间成本是巨大的，因此动物模型只会用在少数被认为具有高免疫原性风险的生物治疗药物上。
讨论
在选择assay的时候需要了解实验结果的意义及其在评估潜在免疫原性风险中的预期用途，例如：1）告知临床安全管理计划，如果结果表明有免疫原性风险则需要调整剂量和ADA监测策略；2）需要在类似的候选分子或者生物类似药中筛选最优的候选分子进入临床开发时；3）需要分析序列可靠性，并将热点位点突变的时候。不同的assay将会提供不同的数据结果，根据不同的目的需要选择最适合的功能模型。
下面从优缺点以及使用场景等方面比较了前面提到的一些assay。
| Assay | Pros | Cons | Utility | Stage |
|---|---|---|---|---|
| In silico algorithms | High throughput Low cost | Solely based on primary sequenceMainly relies on prediction of MHC bindingdo not account for key antigen processing, presentation and T cell recognition processesmost recently developed tools typically include additional selection criterion | Filter-out high-risk variants from large panels of sequencesRank clones of high homologySupport humanization/deimmunization strategies | Early – Discovery |
| DC maturation assays | Consistent responses across donors | Not an assessment of antigenicity or immunogenicity | Assess the effect of external factors on antigen presentation (e.g. aggregation, contaminants) and potentially on immunogenicityAssess potential interference of target-mediated biology with preclinical immunogenicity assays (e.g. anti-TNFs) | Late – Formulation |
| MAPPs | Fairly robust assayRelies on natural antigen processing by DCsData rich | Not all MHC class II binders will be recognized by T cells or trigger an immune responseCurrently only well established for HLA-DR | Identify ‘hot spots’ for humanization/deimmunizationAssess the effect of non-sequence related changes on antigen presentation (e.g. biosimilars) | Early – Lead optimizationIntermediate – Lead selection |
| T cell activation assays | ||||
| Peptide-based assays | No protein requiredAssessment of T cell responses | Linear peptides generated chemically (not all peptides may be generated by the cellular machinery)Varied readouts and assay set-ups used in the industry | Identify ‘hot spots’ for humanization/deimmunization | Early – Lead optimization |
| Whole protein, PBMC assays | Relies on natural antigen processing by DCsAssessment of T cell responses | Immuno-modulating therapeutics may interfere with the readoutVaried readouts and assay set-ups used in the industry | Assessment of frequency of specific TCR in T cell repertoire that recognizes presented peptides of the biotherapeutic across different donors representing a targeted HLA-distribution | Intermediate – Lead selection |
| Whole protein, DC:T cell assays | Relies on natural antigen processing by DCsAssessment of T cell responses | Immuno-modulating therapeutics may interfere with the readoutVaried readouts and assay set-ups used in the industry | Assessment of the uptake, processing, and presentation of the biotherapeutic, followed by assessment of frequency of specific TCR in T cell repertoire that recognizes presented peptides of the biotherapeutic across different donors representing a targeted HLA-distribution | Intermediate – Lead selection |
| B cell assays | Only assay that detects individual antibody-secreting B cells | Currently limited to memory B cell responsesImmuno-modulating therapeutics may interfere with the readoutControls need to recall a response across the donor panel | Assessment of preexisting/cross-reactive antibodies to the biotherapeuticIdentification of B clones in patients producing ADA | Intermediate – Lead selectionPost-hoc analysis |
| In vivo models | To date, only assay involving all steps of immune response required to culminate on ADA formation | Generation of HIS mice is generally costly and laborious, preventing its broad applicationTransgenic systems generally are restricted to a specific protein, including single human HLAIt does not inform on immunogenic human T (and B) cell epitopes | Assessment of product-related factors, including post-translation modifications, formulation and mode-of-action of biotherapeutics | Intermediate – Lead selectionLate – Formulation |
参考文献
Ducret, Axel et al. “Assay format diversity in pre-clinical immunogenicity risk assessment: Toward a possible harmonization of antigenicity assays.” mAbs vol. 14,1 (2022): 1993522. doi:10.1080/19420862.2021.1993522
