ADC发挥活性需要在肿瘤部位释放payload

ADC由三部分组成抗体、连接子和毒素，ADC可以看成一种前药（prodrug），在循环中保持稳定，并且能够将毒素释放到肿瘤然后杀伤肿瘤。释放到肿瘤的毒素是ADC发挥活性的关键，但是这与哪些过程相关，目前还没有完全阐明。

文章构建了5种不同的ADC，A1和A2使用相同的linker-payload，偶联的位点分别为HC A140C和LC K149C；A3和A4也使用相同的linker-payload，偶联的位点分别为HC A140C和LC K149C linker-payload，但是linker与A1和A2的区别是在S-S链接子上多了一个甲基；B1使用的为VC-PAB linker偶连位点为HC A118C。

此处引申一下，这三个定点偶连的位点的差异，从IgG1抗体Fab结构上可以看出LC K149C 和HC A118C两个位点侧链都暴露在溶剂中，而HC A140C这个位点的氨基酸则隐藏在抗体内部为溶剂不可及。因此不同位点的定点偶连对于二硫键linker断裂以及payload的释放有比较大的影响。

然后使用异种移植模型对比A1-4四种不同的ADC在体内的抑瘤活性，并且分析ADC在外周、肿瘤中的暴露与肿瘤抑制之间的关系。A1和A2的剂量为4mg/ml，A3和A4为0.4mg/ml。从抑瘤作用来看A2和A3优于A1和A4,但是根据Tab AUC0-18的数据来看A1以及A2的体内暴露量较高，而ADC在外周的稳定性结果来看A3和A4的优于A1和A2，这些结果发现无论暴露量还是稳定性均与ADC的抑瘤作用不对应。而检测了瘤内的PBD含量发现瘤内payload量与ADC的抑瘤作用有很好的相关性，将肿瘤体积和PBD的含量进行分析发现PBD/bp的比例需要大于1/10^6这个域值才能有效发挥肿瘤抑制功能，对不同时间点的小鼠瘤内PBD的含量分析也能获取对应的域值，结果表明只有A2、A3能够达到并一直保持在域值以上，同时只有这两组小鼠有比较好的药效。

另一个发现是肿瘤内的payload只要达到某个域值就能开始抑制肿瘤，但是额外的毒素对于ADC的抑瘤作用并没有增加，例如上图中的A2和A3有相同的抑瘤效果，但是瘤内的payload浓度A2是A3的两倍以上。如果增加ADC的用药频率不但不能增加抑瘤效果反而导致对正常组织的毒性。为了确认这个发现通过剂量分割将相同的剂量分次给药比较与单次给药的效果，B1单次1mg/kg可以抑制肿瘤生长，而分三周给药每次0.33mg/kg则只能部分抑制肿瘤生长，尽管两种给药方式上暴露量一致。

根据以上的结果我们进一步确认了我们的结论，瘤内释放的payload必须达到某个域值才能发挥抗肿瘤功能。不过这又引发了另一个问题就是这些ADC使用的是相同的抗体同样的毒素，linker只有一个甲基的差异，偶连的方式都是定点偶连。给药的剂量甚至差了10倍，为什么这些ADC的体内抑瘤作用却有较大差异？似乎偶连位点和linker类型对ADC的稳定性和系统暴露以及抑瘤效果都有较大的影响。

虽然使用的是相同的payload，但是payload的释放需要二硫键断开后继续发生自降解。比较LD1和LD2发现在二硫键断开后具有甲基化的LD2迅速发生自降解生成具有活性的PBD，而无甲基化的LD1则生成了稳定的含巯基的中间产物（Thiol 1a and Thiol 1b），这结果说明具有甲基化的linker可以高效的发生自降解，从而释放具有活性的PDB毒素。

对linker的稳定性研究发现无论是中性还是酸性条件A3和A4的主要分解产物是PBD，而A1和A2只有在中性条件下才能主要生成PBD。根据不同时间释放的payload对比发现，偶连的位点对payload的释放有较大的影响，HC A140C因为隐藏在抗体内部使S-S不容易被还原，LC K149C暴露在溶剂中很容易被还原（稳定性A1>A2，A3>A4）。同时带有甲基的linker相对不带甲基的linker也更加的稳定，因为甲基也能保护S-S不被还原（稳定性A3>A1，A4>A2）。

综上，由于无甲基化的linker以及二硫键断开后自降解发生不完全导致A1和A2需要更大的剂量才能达到类似的抑瘤效果。A3和A4的差异则因为偶连位点的原因在低剂量下，A4的二硫键更容易断开从而导致体内的抑瘤效果若于A3；A1和A2的差异是由于自降解以及A1的二硫键断开更慢，导致释放到肿瘤的payload更少，从而效果更差。

讨论

文章发现 1.）ADC随着释放的payload浓度的增加，抑瘤效果明显增加，随后是平台期。2.）肿瘤内的payload需要达到一个域值才能有效发挥ADC的抑瘤作用，PBD的域值约为1PBD/10^6bp。3.）额外的payload不能继续改善肿瘤抑制效果，但可能导致毒性。因此发现有效payload浓度以达到疗效“平台期”很重要，因为向肿瘤输送额外的有效载荷不会提高疗效，但在高剂量或全身ADC暴露下更高的分解代谢物浓度将会以引起毒性。

在另一篇文献中作者将实验进一步扩展到MMAE和DM1、2、3、4的ADC。

文章结果进一步验证了本文的结论，肿瘤内释放的毒素与ADC的抑瘤效果直接相关，瘤内的payload需要达到某个域值后才能发挥抗肿瘤效果，额外的payload并不能增加抗肿瘤效果，并且单次大剂量的抑瘤效果优于剂量分割给药。通过优化linker以及给药剂量可以提高肿瘤内毒素的释放水平。

ADC作为一个大分子能够穿透到实体瘤的比例实在太少，大约0.03-0.08%的ADC能够进入肿瘤，因此ADC在外周的暴露量与其抗肿瘤功能没有直接的关系，后续对于ADC的优化不能仅仅依靠增加外周暴露量。因为肿瘤内payload暴露量与抗肿瘤效果是相关的所以亟需开发通过ADC的暴露量预测肿瘤内payload暴露量的方案，同时也需要增加ADC肿瘤的肿瘤穿透以及payload在肿瘤内的释放效率。常规的增加ADC肿瘤的肿瘤穿透方法包括通过降低亲和力、提高ADC用量、裸抗竞争结合等等，现在来看目前比较简单的就是通过降低亲和力，但是这个具体有多大影响很难说，亲和力除了穿透还会影响内吞效率，前期还是得筛个亲和力较低且内吞良好的抗体；提高ADC的剂量也是个简单粗暴的方法，但是实体瘤中的ADC浓度跟用药剂量并不是线性关系，而且ADC的剂量都是在MTD因此也很难直接增加剂量，目前的方法是通过剂量分割给药方式增加用药频率，从临床效果看确实可以保持患者耐受的前提下提高药效，不过从数据看ORR还是跟剂量正成比；裸抗竞争结合提高ADC的穿透在体外小鼠模型以及一些临床试验也已经看到初步的理论验证。DS-8201a的成功让给了第一三共一招鲜吃遍天的底气同时也给国内的公司依葫芦画瓢的机会，毒素都是Top1i然后linker都是酶裂解的，对linker-payoad的进行优化以求达到并超过第一三共的GGFG-Dxd，不过似乎有些公司所谓的优化只是为了规避专利，报道的数据不外乎体外细胞杀伤加上旁观者效应，临床前动物药效基本都优于DS-8201a，有的ADC平台甚至iostype的抑瘤效果都优于GGFG-Dxd，估计是linker不稳定所至，相当于给小鼠做了一次化疗。尚未仔细做过机制研究就直接上临床，这可能比较大的隐患，通过小鼠的体重来进行安全性评估基本靠不住，只关注药效而忽略安全性将来的临床很难推进，毕竟第一三共曾经就做过依喜替康小分子的临床试验Exatecan与吉西他滨联用对比吉西他滨单药，联用效果基本等于吉西他滨单药但是毒性远大于单药患者获益不明显。增加毒素的毒性也被证明不是一个有效的策略，如果只把目光集中在提高不到总量1%的ADC活性上，那么另外99%的ADC早就杀疯了，ADC的毒性包括特异跟非特异行杀伤，前一种为on-target off-tumor现在没有一个TAA只在肿瘤表达，正常组织也会有TAA表达，后一种包括off-target off-tumor包括通过FcgR内吞进去的ADC或者非特异性胞吞进入细胞或者旁观者效应或者linker的稳定性差导致在循环中发生脱落而引起的杀伤，这些都可能带来剂量限制性毒性导致进一步减少ADC的用量从而影响ADC的治疗效果。

参考文献：

1. Intratumoral Payload Concentration Correlates with the Activity of Antibody–Drug Conjugates

2. Exposure-Efficacy Analysis of Antibody-Drug Conjugates Delivering an Excessive Level of Payload to Tissues

3. Co-administered antibody improves penetration of antibody-dye conjugate into human cancers with implications for antibody-drug conjugates

4. Preliminary results from a First-in-human Study of ESG401, a Trophoblast Cell-Surface Antigen 2 (TROP2) Antibody Drug Conjugate (ADC), in Patients with Locally Advanced/Metastatic Solid Tumors

5. BL-B01D1, a first-in-class EGFRxHER3 bispecific antibody-drug conjugate (ADC), in patients with locally advanced or metastatic solid tumor: Results from a first-in-human phase 1 study