knob-into-hole（KIH）的开发

KIH最早由Genetech开发，用来解决提高重链之间异源二聚比例的问题。在这之前想做成非对称的Ig-like BsAb只能靠运气，将两个野生型的IgG抗体直接混合表达，这种方法无论是组装效率还是工艺开发都具有较大挑战。

设计CH3突变

分析IgG1的晶体结构，发现Fc片段的组装主要依靠CH3之间的相互作用，因此存在将CH3的交接面进行突变而获得异源二聚体的可能性。

CH3/CH3的交接面各由4个方向平行的β折叠股组成，其中有相互作用的氨基酸共有16对，选择突变的位点位于中间的两个β折叠股上，主要是为了防止knob链上的氨基酸将侧链转向到溶剂而形成同源二聚。

根据konbs-into-holles的策略将其中一个CH3交接面的氨基酸突变成侧链较大的氨基酸Y或者W，然后将另一个CH3上紧邻的氨基酸突变成侧链较小的氨基酸A或者T。总共结构设计了三组突变，第一组：一条链T366与另一条链上的Y407之间形成氢键，所以突变为T366Y+Y407T；第二组：一条链上的突变为F405A，另一条链为T394W；第三组为前面两组的组合。

表达

Ab为CD3抗体和IA为CD4-Fc融合蛋白，分别在CD3抗体和CD4-Fc融合蛋白的Fc区域引入knob或者hole突变，然后将突变后的序列组合表达，并通过调整不同的质粒比例以优化Ab/IA产量。下图为表达结果。

A图是野生型的Fc表达后的结果能看到明显的Ab/IA、IgG和IA的复合物，Ab/IA的比例约为50%，IgG和IA分别为25%上下。相反使用KIH的CH3则优秀的多，其中T366Y+Y407T的组合最多可以收获92%的Ab/IA复合物，而且复合物的比例与质粒的比例并不相关，将突变位点互换位置也能得到类似的结果。其余的组合则未能进一步提高比例，并且T394W相比T366Y也更容易形成同源二聚（B图）。

从以上结果来看各单独突变一个位点可以提高异源二聚体的产量，其中较优的组合为T366Y+Y407T，同时将这个组合的位点突变成（T366W+Y407A）也能获得类似的结果。接下来通过噬菌体展示来尝试筛选更优的KIH组合。

噬菌体筛选KIH突变

在使用噬菌体展示筛选稳定的异源二聚体的同时使用盐酸胍（Guanidine HCl）来获得更稳定的突变体。

因为通过之前的实验以及结构分析发现CH3 T366W knob突变，会与另一条CH3上的T366、L368和Y407有空间位阻，因此选择T366、L368和Y407此三个位点进行突变。

首先固定knob端的突变为T366W并在N端加了一个Flag标签；然后hole端为随机突变文库，选择的突变位点为紧邻另一个CH3链上T366的位点（366、368和407位点）；最后通过抗Flag的抗体筛选。

通过7轮的筛选，获得37个克隆得到到6个不同的氨基酸组合。不过从Guanidine HCl变性分析结果可以获知本次筛选的突变体稳定性优于单点突变(T366W+Y407)，差于野生型的Fc，这可能跟突变的CH3交界面上侧链体积的改变相关。

并对每个位置的氨基酸进行分析。366的氨基酸多为亲水性的小氨基酸如S和T，368和407更倾向于出现疏水性的氨基酸如V和A。出现最多的组合为T366S:L368A:Y407V。

CH3异源二聚体的稳定性

根据之前的表格可以获知新筛选的克隆比单点突变的克隆在Guanidine HCl中更加稳定，热稳定性实验也显示T366W+T366S:L368A:Y407V的TM值优于T336W+Y407A。

Ab/IA共表达

接下来使用相同的方法表达CD3抗体和CD4-Fc融合蛋白，比较异源二聚体的产量和比例。与T366W+Y407组合相比T366W+T366S:L368A:Y407V形成同源二聚体的比例更小，特别是hole链形成同源二聚体的比例小了20%，获得异源二聚体的产量并无太大区别。

前面已经筛选到了稳定高效的KIH突变，可以解决重链之间异源二聚的问题，同时如果使用共同轻链则可以形成IgG1-like的BsAb。为了能够进一步提高CH3异源二聚体间的稳定性，决定在CH3之间添加二硫键。

二硫键位点的选择

二硫键位点的选择遵循以下3个规则：

    1.α碳原子之间的距离需要类似于形成天然二硫键之间的距离约为5.0-6.8A。

    2.氨基酸位于CH3交界面，且为不同氨基酸。

    3.氨基酸被半胱氨酸替换后具备合适的空间角度。

根据这些规则一共设计了6对突变分别是K392+D399， V397+T394， S354+L351， S354+Y349， E356+Y349， E357+Y349。这些突变中L351突变发现容易形成同源二聚体以及形成链间二硫键，V397+T394形成二硫键的效率不够高，因此被排除。

将其余突变的组合与KIH突变进行组合表达，比较AB/IA的产量。单独的C突变D399C+K392C突变可以形成最高比例的Ab/IA，其余的突变为50%做有，与野生型的类似，如果跟KIH组合后可以将Ab/IA的比例从86%提高到90%以上。最优的组合为S354C+T366W， Y349C+T366S+L368A+Y407V。

最后选择最优的组合构建共轻链双抗，我们可以看到lane2中双抗的比例较高，大小与lane4、5、6单抗(野生型重链HH.wt和HM.wt与轻链LMH的组合)类似，单独的knob（lane1）或者hole（lan3）与轻链组合表达条带较乱，比例最大的为H+L的单体。

突变后的Fc具有与野生型类似的ADCC功能。这个不是重点不在赘述。

讨论

双抗可以设计出单抗所没有的机制，在临床上展现了巨大的潜力，但是如何根据不同的机制设计合理的双抗是抗体工程的研究重点。本文介绍的KIH是构建双抗的一种方法，从中可以看到很多现在比较流行的技术KIH以及common light chain等等很多fundamental research人二十几年前就开始做了，咱们还得正视差距砥砺前行。目前上市的双抗中mosunetuzumab（CD20 x CD3）使用的就是KIH突变，不过更多的使用KIH以及KIH衍生来的双抗正在临床开发中。

参考文献

1. Ridgway, Presta, and Carter 1996

2. Atwell et al. 1997

3. Merchant et al. 1998