纳米抗体：从高通量筛选到药物开发

单域抗体片段，通常被称为纳米抗体（nAb），凭借其仅是传统单克隆抗体(mAbs)尺寸一小部分的大小，却实现了与mAbs相同的靶向能力。这些片段是从骆驼科动物中提取出来的（包括美洲驼、羊驼和骆驼等），由于它们在15 kDa左右的小分子量、低结构复杂性和与常规抗体相比更高的稳定性，纳米抗体技术已经获得了生物制剂开发的广泛关注。今天分享的这篇综述介绍了纳米抗体的结构特征、结合模式以及在高通量筛选的方法，讨论了纳米抗体在生物医学研究和治疗开发中的作用，包括它们的优势、应用领域以及未来的发展趋势。

背景

抗体的高靶向能力使得它们成为科学研究和药物开发中最广泛应用的生物制剂之一。基于抗体的疗法在对抗多种人类疾病，尤其是癌症方面具有较大优势。一种独特的单域抗体片段，称为nanobody（Ablynx NV, Sanofi的注册商标），作为传统单克隆抗体（mAb）精确靶向能力的替代方案，与mAb相比具有多项优势同时也具有互补作用。这些纳米抗体源自骆驼类动物中独特的重链抗体，这些重链抗体仅由重链同二聚体组成没有伴随轻链（图1）。

纳米抗体在大约15 kDa大小下，它们是目前已知的自然界中所有抗体中最小的抗原结合域。由于其小分子量，纳米抗体可以靶向常规抗体无法结合的隐蔽表位，并且生产过程相比其他mAbs更为简单，它们具有广泛的应用范围，从晶体学辅助物到诊断开发，等等。

筛选方法

近年来，产生了多种方法筛选纳米抗体，这些方法都强调了与传统单克隆抗体相比纳米抗体生产过程相对较为简单。这些技术的共同点在于，都需要用免疫的骆驼科动物（通常是美洲驼和羊驼，偶尔也会包括骆驼）的免疫细胞建一个大的、多样性的纳米抗体文库，有时候为了节省成本和时间可以使用5-10种不同的抗原来进行免疫接种，在这种情况不会减弱免疫反应强度。纳米抗体筛选方法包括：通过对文库（噬菌体、酵母或核糖体文库）的表达和展示进行筛选，或者直接检测相关血清抗体（基于质谱的筛选）（图2）。

由于饲养骆驼的要求较高并且需要外包，因此已经通过基因工程改造了小鼠，使其表达纳米抗体，能够在对抗原的响应中成熟重链抗体。这种方式提供了更易在实验室操作的选择，不过这些小鼠的整体免疫多样性显著低于真正的骆驼。简而言之，纳米抗体的开发过程相对于传统的单克隆抗体更加简单和高效。虽然使用工程小鼠可以提供一个实验室内的替代方案，但这种方法在总体上可能无法完全重复骆驼科动物体内的广泛而多样化的免疫响应。

除此之外，使用大型且多样化的天然库或者合成文库进行纳米抗体筛选为研究人员提供了另一个选项，这种方法节省了时间和资源，也减少了对动物实验的需求。然而，通过天然文库筛选出的抗体通常具有较低的亲和力，可能需要进一步的亲和力成熟来达到与传统免疫获得的纳米抗体相匹配的高特异性和亲和力。因此，在实际应用中，除非是一些特殊的抗原或者在较难获得实验动物时，否则不建议使用天然文库或者合成文库。

纳米抗体组库的优势

通过对纳米抗体组库的分析发现，纳米抗体可以靶向一些隐藏的表位，这是靶向相同抗原的传统抗体所无法识别的。一般认为，纳米抗体的小体积是其能够结合这些隐藏表位的关键。此外，大量研究通过收集PDB中的结构信息也证明了纳米抗体可以通过不同的方式与抗原结合（通常利用它们的框架区域来实现），这极大地丰富了纳米抗体对整个抗原表面的全面采样，以便于识别和结合各种形状的表位。这与传统抗体形成鲜明对比，传统抗体主要通过其CDR与抗原相互作用。相对自由的相互作用方向和利用FR区域的能力使纳米抗体与抗原结合时能够产生独特的表位结合表面（互补位）。见下图纳米抗体与抗原的三种不同结合模式。

这些不同的结合模式具有的优势包括：（i）对抗原表面的全面采样;（ii）结合抗原上的多个不同表位；（iii）使多个纳米抗体能够同时结合同一抗原。当将纳米抗体技术应用于治疗和诊断的生成时，多个纳米抗体同时结合单个抗原的能力特别有用，尤其是针对快速传播的疾病病原体的抗原。

纳米抗体的应用

研究人员充分利用了纳米抗体的独特优势在研究领域和临床领域都开发了一系列的应用。纳米抗体因其体积小和易于修改的特性，在蛋白组学研究中得到了广泛应用，特别是用于蛋白质复合物的纯化；靶向常见的标签如GFP或多肽标签的纳米抗体也逐渐取代了传统抗体。相比于传统的抗体免疫沉淀法，纳米抗体保留了高亲和力和特异性的同时，提供了更简便的生产和成本效益。此外，纳米抗体可以用于异源系统中的体内表达，并广泛应用于细胞内的蛋白定位、进行蛋白组学和互作研究。纳米抗体在传染病领域的应用，SARS-CoV-2是针对快速传播的病原体的治疗解决方案的主要试验台，许多研究证明了纳米抗体的独特特性。COVID-19大流行见证了纳米抗体的开发急剧增加，应用于对SARS-CoV-2病毒的治疗和诊断。业界鉴定出许多SARS-CoV-2刺突中和纳米抗体，其结合的刺突表位与传统抗体结合的结合表位不同，其中一些表位在SARS-CoV-2变体之间显示出很强的保守性，这些纳米抗体在中和新出现的病毒株方面仍然有效，而传统抗体则随着病毒新毒株的迅速出现而开始失去病毒中和功效。

纳米抗体的可开性

在开发纳米抗体疗法时需要考虑的关键设计要素包括：1.纳米抗体的人源化：这一步旨在降低潜在的免疫原性，通常通过将纳米抗体的框架区进行人源化改造，尤其是FR2区域是骆驼科VHH与人VH差异较大的区域，不过一般FR2会参与到与抗原的相互作用或影响抗体的理化特性所以修改的时候需要做一定的取舍；

2.最终药物结构与寡聚状态的优化：这一步骤通常需要调整以防止纳米抗体在系统中过快清除或提高其对抗原的结合能力，包括确定最佳的分子构型以确保药物的有效性和持久性。蛋白质治疗药物的一个主要问题是生产或储存过程中的酶或化学修饰。糖基化、脱酰胺、氧化等翻译后修饰（PTM）会影响治疗效果和生物利用度，控制和识别此类变化是生物药物开发中的重大挑战。基于纳米抗体的疗法与蛋白质产品一样存在许多挑战，但相对于传统抗体来说，纳米抗体更小更简单的结构使其更适合生产、优化和分析。3.药物给药途径：这是与2中的寡聚状态相联系的，影响药物的生物利用度。选择合适的给药方式（如静脉内、肌肉注射或口服）对药物的吸收、分布、代谢和排泄有直接影响，从而影响其在体内的效果和安全性。这些设计要素是确保纳米抗体疗法安全有效、可制造并且能够被患者接受的关键考虑因素。

前景

越来越多的纳米抗体筛选以及表征技术的出现推动了纳米抗体在多个研究领域应用，近年来，随着多款基于纳米抗体的药物进入临床，人们对于纳米抗体疗法的应用兴趣显著增强。相较于传统抗体，纳米抗体可以覆盖更大的表位空间，使它们可以结合到难以靶向的抗原表位，并且能够产生强大的协同效应。因此，纳米抗体是联用和多表位抗体的理想候选对象，较小的体积也适合更广泛的功能性改造。

参考文献

Nanobodies: from high-throughput identification to therapeutic development