Nectin-4 x CD28 双特异性抗体
今天分享的是一个CD28 x Nectin-4，这个抗体来自Rondo Therapeutics，这公司的管线聚焦于激活T细胞的第一和第二信号以提高T细胞的抗肿瘤功能，今天介绍的RNDO-564是他们的第一个管线。他们的团队成员大部分来自Teneobio，具有丰富的双特异性抗体特别是TCE开发经验。根据他们官网的介绍，RNDO-564是一个全人源CD28 x Nectin-4双特异性抗体，临床前实验显示这个抗体不但单药就具备较强的抗肿瘤活性而且与免疫检查点或者TCE联用具备协同效果，他们通过对Nectin-4和CD28亲和力的微调使其在靶毒性降到最弱，在正常组织中不会激活CD28信号。
CD28抗体筛选
CD28抗体来源于全人源共轻链大鼠，通过高通量筛选最后获得27个单抗进行评估，分别检测了对Jurkat细胞的结合、CD28以及同家族或者非相关蛋白的结合、与OKT-3组合对CD4T细胞的激活。结果显示25个抗体特异性的结合人CD28,其中1个抗体与OKT3组合后激活T细胞后释放的IL2超过了OKT3单抗不过低于TGN1412，CDR3序列相似度分析显示这27个抗体分别来源于6个克隆型，然后从高通量测序的抗体组库中将来源于这6个克隆型的269序列重新进行了新一轮筛选，最终获得了5个不同亲和力的CD28抗体并将他们构建成双特性抗体。
CD28 x Nectin-4抗体设计以及结合特性
Nectin-4来源于同一个全人共轻链大鼠，与人Nectin的亲和力为124pM。双抗的结构为1:1，使用共轻链，恒定区为IgG4,通过KIH技术形成异二聚体。这5个双抗与CD28蛋白的结合呈现出由高到底的结合趋势，与Nectin-4的结合均保持一致。
CD28×Nectin-4 BSABS表现出靶点依赖性和第一信号依赖性的T细胞共刺激
完整T细胞的激活依赖于TCR的第一信号、共刺激信号以及细胞因子提供的第三信号，这边检测CD28双抗的活性通过联用5T4 x CD3的双抗（用来提供第一信号）。杀伤体系中CD3双抗的浓度低于有效的杀伤剂量，在此基础上通过添加CD28双抗提高T细胞杀伤活性，所有的CD28双抗均显示出剂量依赖的肿瘤细胞杀伤，IL2的释放和T细胞激活也显示出相同的趋势，对Nectin-4阴性细胞并没有显示出杀伤和L2释放。与TGN1412相比固定双抗后对PBMC也没有明显的激活，TGN1412则显示出较高水平的IFN-r释放。
在没有CD3双抗提供第一信号的时候，CD28双抗则完全没有活性。
CD28共刺激信号在较低ET比下仍能发挥有效杀伤
首先在ET比为5:1时，CD3双抗可以发挥完整的肿瘤细胞杀伤，体系中增加了4 μg/mL的CD28双抗后可以进一步增加肿瘤细胞的杀伤。然后在ET比为1:4时，CD3双抗则没有明显的肿瘤细胞杀伤能力，加入CD28双抗后不同程度的增加了对肿瘤细胞的杀伤水平。释放的细胞因子主要为IL2，同时少量提高了IFN-γ、IL-4、IL-10、IL-1β和TNF-α，然而与CRS相关的IL-6并没有上升。
临床候选的分子的选择同时考虑了杀伤强度和最大杀伤水平，CD28_075 x Nectin-4_001可以同时保证更大的治疗窗口和最大的杀伤水平，因此被命名为RNDO-564并进入临床开发。
RNDO-564可以在Nectin-4阳性细胞和阴性细胞的混合体系中杀伤肿瘤
根据UC患者组织样品发现Nectin-4的阳性率从9%到51%不等（A）。因此在体外的杀伤体系中也模拟了不同比例的阴性细胞，同样在CD3双抗低于有效杀伤剂量的条件下，RNDO-564可以同时增加对Nectin-4阳性细胞和阴性细胞的杀伤，而且杀伤水平随着阴性细胞的比例增加而减弱直到没有阳性细胞的时候（B）。将患者样品与T细胞共培养，同时加入CD3双抗和RNDO-564后T细胞的激活最强，其次是CD3双抗，而这里可以看到单独的RNDO-564也能激活T细胞并释放少量IL2可能是因为患者样品中少量的TILs存在。根据染色结果，T细胞的激活水平与Nectin-4的阳性率强度存在一定的关系。
RNDO-564可以逆转T细胞的耗竭
肿瘤微环境中的T细胞随着长期的刺激最终会进入耗竭的状态丧失杀伤能力。体外实验显示新鲜的T细胞具备较强的杀伤能力，而长期单独使用CD3双抗刺激后T细胞的杀伤能力会逐渐减弱，加入RNDO-564则可以完全恢复杀伤能力（A）。
因为CD28共刺激信号激活会释放较高水平的IL2因此在杀伤体系中加入IL2或者IL2抗体，在单独的CD3双抗杀伤体系中加入IL2或者IL2抗体发现加入IL2后可以极大的提高耗竭T细胞的杀伤水平而加入IL2抗体后杀伤水平甚至弱于单独使用CD3双抗，可能是因为CD3双抗也会刺激耗竭的T细胞释放少量的IL2但是IL2抗体将这些IL2完全的中和掉了导致杀伤活性进一步降低。在CD3双抗和RNDO-564联用的体系中加入IL2抗体后虽然T细胞的杀伤能力会减弱，但是并没有完全的消失，这说明CD28的共刺激信号通过非IL2依赖的途径增强了T细胞的杀伤能力。
体内实验
在CD28人源化小鼠中，RNDO-564单用或者与PD-1抗体联用均能较好的抑制表达人Ncetin-4蛋白的MC38细胞，而且在联用组显示出了更好的协同效果。
讨论
从临床前的数据来看RND0-564具备较好的安全性和有效性，对T细胞的激活依赖于第一信号和Nectin-4阳性细胞，可以增强第一信号的抗肿瘤活性和有效逆转T细胞耗竭。虽然CD28在T细胞上表达比较广泛，通过微调亲和力可以一定程度上体现出抗原依赖的激活，不过Nectin-4这靶点的表达也比较广泛不晓得能否避免杀伤正常组织。
CD28的开发有很长一段时间因为TGN1412而暂停，近年来随着对免疫疗法的了解以及双抗技术的进步将CD28开发成靶点依赖的激活已经变得可能。之前我也分享过赛诺菲的一款CD28抗体，虽然结果不尽如人意但是仍有一大批的公司都在进行共刺激信号的开发。毕竟基于第一信号的免疫检查点和TCE疗法虽然在实体瘤里面获得成功但是都面临响应率低和有效性依旧不足的缺点，如果谁能在共刺激信号开发的领域找到一个缺口那可是一大片的蓝海。
参考文献
- Potency-optimized CD28-activating bispecific antibody for the targeted treatment of Nectin-4 positive cancers
