抗体表面电荷的分布对抗体分子间相互作用和粘度的影响

生物制药对于先导分子的成药性有比较高的要求尤其是稳定性，因为生物药大都是通过非肠道途径给药，所以药物制剂必须制成溶液或者冻干粉，其中粘度对于生物药制备成高浓度制剂有着至关重要的影响。

介绍

过去几年，将生物药制成高浓度制剂是通过调整制剂配方来调整粘度的影响，比如溶剂pH、金属离子强度、霍夫迈斯特盐等共存溶质、疏水剂、糖类和一些氨基酸添加剂如精氨酸盐等。另外有一些研究聚焦于分子层面的特性对高浓度下粘度的影响，比如静电荷、分子大小、形状、分子间相互作用和偶极矩。序列相似度高达90-95%的抗体分子在制剂中的表现差距巨大，因此可能有一些关键氨基酸基序对抗体粘度有重要影响。

这篇文献研究了两个抗体，MAb-1和MAb-2,它们在高浓度下有不同的粘度和聚集的表现。研究中对抗体可变区中带电荷的氨基酸进行替换来研究对粘度和聚集的影响。结果显示，MAb-1的CDR上暴露的带电氨基酸影响MAb-1抗体的聚集和粘度，如果将这些氨基酸替换成MAb-2上对应的氨基酸则会减少抗体的聚集并且降低高浓度下的粘度。然而，如果将这些氨基酸移植到MAb-2上并没有影响抗体聚集的情况也没有增加高浓度下的粘度，因此具体的原因还得进一步研究。

粘度测定

图1总结了粘度检测的结果，MAb1的突变体M5、M6、M7粘度都不同程度降低，然而MAb2的突变体粘度并为发生增加。这些结果说明除了电荷还有其他的因素导致粘度以及聚集的发生。

DLS

图2显示了MAb-1/2以及突变体M10/13/15的扩散系数(Dm)，通过线性拟合斜率可以获得扩散相互作用参数(kD),与B22(平衡热力学相互作用参数)不同，kD也能反映流体性质。因此，正值的kD反映分子间排斥作用，只有低于-5.34mL/g的复制才能代表分子间的相互吸引。在pH=6.0，15mM的离子浓度下MAb-1的kD为-19.79 ± 1.1mL/g，MAb-2的kD为+11.09 ± 0.07 mL/ g，对于MAb-2的突变并未能增加突变体的相互作用。所有分子的kD值都在表2中展示。

抗体的净电荷

抗体在pH6.0下的净电荷分别使用一级结构计算、ELS和MCE测得表2。尽管其中部分的抗体分子间相互作用和粘度的行为可以通过净电荷来解释，但是M6/10却显示虽然降低了净电荷，同时M6的粘度发生了降低，M10的粘度却未发生变化，但是M6/10的分子间作用显示的是M6为相互吸引M10为相互排斥。这种分子净电荷与粘度的不对应关系与之前的文献有所呼应，但是抗体在高浓度下的聚集和粘度主要与静电相互作用相关并且可以通过添加盐或者离子来调节。

随着浓度的上升，分子间距离也越来越短，分子的净电荷可能并不能用来解释溶剂中的受力情况，图3显示平均的表面间隔距离随着浓度的增加而减少，德拜长度与离子强度成反相关。这结果说明在低离子浓度是如果抗体浓度高于100mg/mL，那么抗体分子将不能视做点电荷，分子表面电荷不对称分布导致的相互作用将起到主导作用。

抗体表面电荷分布

图4显示了抗体表面电荷的分布。

为了阐明表面电荷分布诱导的电荷-电荷相互作用对IgG1的聚集和粘度行为的热力学贡献，使用SLS确定了第二维里系数（B22）。

SLS

图5比较了抗体的德拜图，德拜图中的拟合直线斜率为第二维里系数。

B22与蛋白沉淀、溶解度、结晶和聚集有很好的相关性， 然而还是需要区分分子间相互作用如何影响粘度 。粘度或流动阻力是流动层之间动量传递的结果，这受大系统中分子性质的影响。 排斥相互作用（B22>0）的存在被称为“良好”溶剂条件，可防止分子缔合并增强胶体稳定性。

尽管分子间的排斥会带来粘度上升，但是与相互吸引的相互作用相比排斥作用将会增加动量传递从而带来相对较少的粘度上升。相反，分子间引力的增加会引起聚集和沉淀从而阻碍动量传递减缓分子扩散，表现为Dm值下降。

需要注意的是尽管随着浓度上升这种可逆聚集将会增加粘度，但是不可逆的聚集将会导致沉淀从而表现为粘度下降。图6阐述了粘度在可逆聚集和不可逆聚集间不同的变化。

表面电荷分布与分子间相互作用的相关性

表面电荷分布均匀将会有利于分子间的相互排斥作用并阻碍聚集，从而在增加浓度时表现为降低重均分子量(Mw,app)，相反，高度不对称的电荷分布将会使得相反电荷相互吸引导致聚集沉淀。 在较小的分离距离时，分子表面将呈现互补的取向，以对准相反的电荷，从而最小化系统的自由能，可能导致长程有序，并限制相互扩散和动量传递，从而导致更高的能量在粘性流中消散。这些流体动力学相互作用的贡献可以通过结合静态和动态光散射数据来可视化。

MAb-1表现出不均匀的表面电荷，CDR上的负电荷区域可以与正电荷区域发生相互作用，这反映在B22的负值上。MAb-1虽然整体分子是带正净电荷，但是随着浓度的增加抗体分子不能被视作点电荷，从而表面电荷的分布可能会影响分子间的相互作用。电荷相互吸引作用的存在有利于抗体的聚集导致结构因子的增加(图7A)和流体动力学相互作用降低，表明MAb-1中动量传递的减少，这导致MAb-1在高浓度下的粘度更高。相反MAb-2表面电荷更加均一，更有利于分子间的排斥作用(图5D，7A)，这种排斥会增加动量传递导致流体动力学相互作用增加(图7B)，从而MAb-2表现为低粘度(图1)。

盐的作用进一步支持了基于电荷异质性的静电相互作用参与调节MAb-1和MAb-2的粘度和聚集。盐的添加减轻了表面电荷的静电相互作用，导致相互吸引的降低和Mw的降低图7。

结论

蛋白质的表面静电荷分布在分子间相互作用以及高浓度下聚集和粘度行为中起主导作用。电荷分布的异质性能够降低了蛋白质分子之间的净排斥力，并可能导致分子间吸引，尽管整个分子为净正电荷。特别是，表面电荷分布的影响在高浓度下被放大，其中相反电荷可以排列成长程有序和高粘性，如MAb-1所示。

参考文献

The Influence of Charge Distribution on Self-Association and Viscosity Behavior of Monoclonal Antibody Solutions