T细胞靶向的双特异性抗体(TCE)引起CRS的机制探究

今天分享的是罗氏的一篇文章，这篇文章作者研究了发生因子风暴的整个动态过程，发现了早期触发因子分泌的因素以及随后信号放大的过程，同时也对比已知的CRS缓解措施在体内体外对因子释放和CD20-TCB功能的影响。其实这班人去年也发了一篇文章，得到的结论跟这篇的差不多，T细胞触发了因子分泌随后单核细胞和中性粒细胞放大了这一过程。

背景

T细胞连接器(TCB)在肿瘤治疗领域特别是血液瘤中具有很好的治疗前景，TCB通过同时结合肿瘤细胞上的TAA和T细胞上的CD3ε亚基，促使T细胞和肿瘤细胞之间形成免疫突触诱导T细胞释放穿孔素和颗粒酶从而杀伤肿瘤细胞。尽管如此，TCB对T细胞的特异性激活也会引起细胞因子的释放，甚至是因子风暴。因子风暴是由于对T细胞以及固有免疫细胞过度激活所至，会引起患者发热、低血压和呼吸缺陷，甚至器官衰竭。临床上预防或者控制因子风暴的方法包括使用高剂量的糖皮质激素、IL-6R抗体、剂量递增给药(step-up dosing)、分次给药或者预先清除部分靶细胞也可以减少on-target因子分泌。尽管进行干预仍时常有发生CRS的情况，因此探究TCB引起CRS背后的机理指导临床设计合适的策略来减少因子分泌并维持T细胞杀伤能力。

结果

CD20-TCB在全血中对T细胞的激活、因子分泌、驱化因子分泌

在全血中加入CD20-TCB后检测2、6和20小时的因子分泌。2小时的时候可以检测到B细胞的清除以及T细胞的激活，到了20小时可见最大比例的B细胞清除以及T细胞激活(图1A、B)。与此同时6小时后可以检测到IFN-γ, TNF-α, IL-2, IP-10, MCP-1, MIP-1α, MIP-1β, IL-1β 和 IL-1Ra等因子的分泌，其中IL-6和IL-8在6小时时开始被检测到到20小时浓度提升最多，其中IL8和IL-10可能由于被消耗而发生减少(图1C)。这与CD20-TCB在临床试验(NP30179)上的因子变化趋势一致(图1D)。

CD20-TCB对全血激活后的单细胞RNA测序分析

在加入CD20-TCB的全血经过2、4、6和20小时后，通过scRNA测序分析因子分泌的动态过程。根据scRNA测序的UMAP图分析可以区分全血中不同的免疫细胞簇包括CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、NK、DCs、B细胞、单核细胞以及群体最大的中性粒细胞，除此之外还有由于TCB的桥接而连在一起的T细胞和B细胞，且这种双阳的细胞数量随时间的增加而增加(图2B、C)。对比使用CD20-TCB和未使用CD20-TCB处理的全血UMAP可以看出CD20-TCB处理的全血从4小时开始T细胞、单核细胞和中性粒细胞群体的变化(图2D)。使用线性混合模型来量化转录组的变化，结果显示CD4+和CD8+ T细胞、中性粒细胞和单核细胞是受CD20-TCB影响最大的细胞群体(图2E)。

全血单细胞RNA测序分析在时间维度上因子释放的信号通路动态

在2-4小时CD4+ T细胞、CD8+ T 细胞、单核细胞和中性粒细胞就开始有炎性信号在转录水平的变化。而且单核细胞和中性粒细胞在2-4小时的信号通路的改变强于T细胞并在20小时时达到最大，这说明单核细胞和中性粒细胞对炎性信号的反应和放大起到重要作用(图3A)。进一步对不同细胞分泌的因子进行研究发现，IFN-γ主要由T细胞释放也包括部分NK细胞，在处理后的2小时内开始转录；TNF-α由多种免疫细胞释放，包括CD8+ T、MAIT T、单核细胞、中性粒细胞、pDC和cDC细胞等，在处理后的2-4开始转录；单核细胞、中性粒细胞和部分cDC细胞是主要的IL-1β和IL-8来源，处理后的2小时开始转录；T细胞在20小时后才会大量上调IL-8的表达；IL-6在2-6小时时主要由单核细胞最先表达，之后到20小时桥连的TB细胞、pDC和cDC才开始表达；表达MCP-1的细胞包括单核细胞、pDC和cDC细胞，从4小时开始；大部分免疫细胞从2小时开始转录MIP-1α (CCL3) 和 MIP-1β (CCL4)基因，除了中性粒细胞、pDC和cDC细胞，它么需到4小时才开始转录这些基因；单核细胞和cDC在4小时就开始转录IP-10，相互作用的TB细胞和pDC细胞的转录则比较少(图3B-E，图S8)。

综上，这些数据说明因子风暴早期由CD4+ T和CD8+ T分泌的IFN-γ和TNF-α开始触发，随后的放大过程由单核细胞、中性粒细胞以及T细胞分泌的TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-8, MCP-1, MIP-1α, MIP-1β 和 IP-10等因子完成。

TCB孵育的全血上清对内皮细胞的影响

内皮细胞在CRS里也扮演重要的角色，因此评估了全血中的因子对内皮细胞的影响。使用CD20-TCB处理后的全血，将里面的免疫细胞过滤掉再孵育HUVECs细胞(图4AB)。培养后的HUVECs被激活开始上调粘附因子ICAM和VCAM(图4C)。与此同时，RNA测序的结果也证实一些因子的mRNA也开始转录(图4D)，这些数据说明内皮细胞可能通过释放趋化因子招募附近的T细胞和髓系细胞，并且通过释放IL-1β和IL-6促进因子风暴。

体外模拟临床缓解因子风暴的策略对因子分泌和杀伤的影响

接下来文章探索了TNF-α 阻断 (adalimumab), IL-6R 阻断 (tocilizumab), IL-1β 阻断 (NLRP3 抑制剂) 和 dexamethasone对CD20-TCB介导的因子分泌和杀伤活性的影响。体外的实验显示dexamethasone可以广泛的抑制所有细胞因子和趋化因子的分泌(图5A)；TNF-α 阻断可以抑制除IL-6和IFN-γ以外的大部分因子；LRP3 抑制剂可以抑制IL-1β 和部分IL-6以及IL-8；相反IL-6R抑制并不能抑制CD20-TCB引起的大部分细胞因子，可能是体系中没有IL6-R的原因？

同时检测了T细胞的杀伤功能，dexamethasone和NLRP3 抑制剂对杀伤有一些影响；TNF-α 阻断和IL-6R 阻断对T细胞杀伤功能没有影响(图5B)；dexamethasone对T细胞的活化有一些影响，特别是对CD8+ T细胞(图5C)。这些数据说明在体外dexamethasone的使用会同时减少因子分泌以及T细胞的激活，而其他方式并没有观察到类似的现象。

小鼠体内模拟临床缓解因子风暴的策略对因子分泌和杀伤的影响

在OCI-Ly18_HSC-NSG小鼠中使用以上相同的反法来评价CD20-TCB介导的因子分泌以及抗肿瘤活性。在用药前小鼠经过了obinutuzumab的预处理，这种方法与临床上的用药方式类似主要就是为了减少靶细胞而降低因子风暴的风险，罗氏曾经发文介绍过这种方法，感兴趣的可以自己去读(3, 7, 33)。

dexamethasone和TNF-α 阻断可以抑制T细胞和髓系细胞细胞相关的细胞因子(图6A)；相反NLRP3 抑制剂和IL-1R阻断效果弱于dexamethasone和TNF-α 阻断只能部分影响因子分泌；而IL-6R的阻断对因子分泌的影响最少，除了能够抑制IP-10(图6A)。

从抗肿瘤效果来看dexamethasone的处理并没有影响CD20-TCB的抑瘤效果，同样阻断IL-1R、阻断IL-6R以及使用NLRP3 抑制剂也不会影响抗肿瘤效果，和瘤内CD8+ T细胞的浸润(图6BC)，但是TNF-α 阻断则对抑瘤作用和T细胞浸润影响较大。这可能和T细胞的迁移需要大量的细胞因子而TNF-α 阻断后，因子的分泌被极大的抑制，从而影响了CD20-TCB的抗肿瘤活性。

以上的数据说明dexamethasone、NLRP3 抑制剂、IL-1R阻断或者IL-6R阻断 并不会抑制CD20-TCB的抗肿瘤活性，但是dexamethasone不仅可以极大的抑制细胞因子的分泌同时也最大的保留了TCB的抗肿瘤活性。相反adalimumab不仅可以广泛的抑制细胞因子分泌也抑制了TCB的抗肿瘤活性。

讨论

目前CAR-T和TCB都时比较具有前景的抗肿瘤方法，同时它们又都会面临免疫细胞过度激活后的因子风暴。在CAR-T疗法中，CRS一般在用药10天后才会发生，其中GM-CSF和IFN-γ被认为是触发因子风暴的因子；而TCB疗法，CRS一般发生在首次给药后，在后续的给药后因子风暴的风险逐渐减少。

在本篇文章他们模拟检测了首次给药后因子风暴的发生过程，并比较了临床上常用的减低因子分泌的一些手段。发现因子的分泌由T细胞最先启动，随后激活的髓系细胞和内皮细胞进一步放大了因子信号，抑制CRS的方法中只有dexamethasone可以同时极大的降低因子分泌并保持TCB的抗肿瘤活性。

参考文献

1. Dissecting the mechanism of cytokine release induced by T-cell engagers highlights the contribution of neutrophils

2. Dissecting the mechanisms underlying the Cytokine Release Syndrome (CRS) mediated by T Cell Bispecific Antibodies