TRuCs的设计

这篇文章介绍了一种在TCR复合物的亚基上融合抗体然后通过天然的TCR信号杀伤靶细胞的方法。与CAR-T不同，TRuCs是作为TCR复合物的一部分，通过抗体识别抗原，然后通过TCR传递杀伤信号。在体外实验中TRuC-T杀伤肿瘤的能力与CAR-T类似，但是释放的细胞因子更少。在小鼠模型中TRuC-T抑制效果比CAR-T更强。

TRuCs的设计背景

选择了CAR-T使用的抗CD19 ScFv FMC63通过3xG4S linker融合到TCR复合物的亚基N端，包括TCRα、TCRβ、CD3γ、CD3δ以及CD3ε，没有选择CD3ζ是因为之前尝试过在CD3ζ的N端融合蛋白会阻止它组成TCR复合物。同时选择了两个上市的CD19 CAR-T作为对照分别命名为28ζ CAR和BBζ CAR。下图的a，b为TRuCs示意图，因为一个TCR复合物中有两个CD3ε所以当抗体融合到CD3ε的N端时TCR复合物中会有两个ScFv，其余的亚基表面只有一个ScFv。(背景：TCR复合物只有在高尔基体中组装完整时才会转运到细胞表面，单独的亚基会被直接降解而不会转运到细胞膜上的)

同时使用GFP和anti-F(ab‘)2检测慢病毒的转染效率和TRuC的表达水平，下图中的c显示T细胞表达GFP的比例为4-%-87%不等，而TRuC的表达水平为9%-85%，这除了慢病毒转染的包装问题以及转染效率有差异以外，不同的TRuC整合到TCR的效率也有差异。图d是在两个不同的donor中的转染结果，结果显示BBζ CAR的表达水平最高，其次是28ζ CAR和ε-TRuC。

TRuC可以整合为TCR的一部分，且不会对TCR功能产生影响

理论上TRuC只有整合到TCR才能在细胞膜上检测到，因此在Jurkat细胞转染上TRuCs 和CARs后通过WB和IP检测是否与设想一致。图a，通过非变性电泳可以检测到对照Jurkat细胞上450kDa的TCR复合物，同时TRuCs也能检测到，在450kDa的上面可以同时检测到有一个条带，是因为Jurkat细胞本身就有全部野生型的亚基，携带抗体的TRuCs整合进去的效率并不是百分百，有整合进去的还有野生型的所以能看到两个条带，而ε-TRuC能看到三个条带是因为每个TCR复合物中有两个CD3ε所以有三种可能性；下图b是使用anti-mouse F(ab‘)2做的IP，然后使用还原电泳检测TCR复合物的各个亚基。从结果看α-TRuC、β-TRuC、γ-TRuC、δ-TRuC以及ε-TRuC都能将TCR复合物的6个亚基拉下拉，这也说明TRuCs可以整合到TCR复合物中，其中ε-TRuC能够拉下来的复合物最多，δ-TRuC最少，而CAR则与TCR复合物并不相关；然后作者在RPMI-8226细胞中单独转染了ε-TRuC以及28ζ CAR和BBζ CAR，不过并为能在细胞上检测到ε-TRuC，而28ζ CAR和BBζ CAR则可以在RPMI-8226细胞上表达；下图c是在表达有流感病毒特异性TCR HA1.7的Jurkat中分别转染ε-TRuC、28ζ CAR和BBζ CAR，可以看出三者的转染效率一致，ε-TRuC的表达量稍低。图d是使用特异性的p-HLA刺激转染后的T细胞，可以发现无抗原刺激时28ζ CAR和BBζ CAR都有CD69表达，转染ε-TRuC的T细胞与未转染的T细胞表现一致只有在抗原刺激下才表达CD69。这说明TRuC并不会影响T细胞的功能，CAR则会提高T细胞的tonic信号。

TRuC结合到抗原可以激活T细胞杀伤靶细胞

下图a是TRuC-T和CAR-T对Nalm6细胞的杀伤，效靶比为1:4，杀伤时间为24h，所有的TRuC-T都能有效杀伤值靶细胞，其中ε-TRuC和γ-TRuC的杀伤最强与CAR-T类似，α-、β-以及 δ-TRuC-T杀伤较弱；下图b是TRuC-T和CAR-T对转染CD19的Hela细胞的杀伤实时动态分析，效靶比为1:12，杀伤持续120小时。所有的TRuC-T和CAR-T基本完全杀伤靶细胞；图c选择了ε-TRuC和γ-TRuC在不同donor中的杀伤情况，TRuC-T和CAR-T的靶细胞杀伤在不同的donor中都比较稳定。

图d检测的是T细胞表面CD107a的表达，ε-TRuC、γ-TRuC、C28ζ CAR和BBζ CAR杀伤阳性细胞时都能检测到CD107a，说明杀伤都比较特异，同时TRuC-T和CAR-T释放的颗粒酶和穿孔素也基本在同一水平（图e，f）；TRuC-T释放的因子水平总体低于CAR-T（图g-m），其中C28ζ CAR释放的因子水平最高，其次是ε-TRuC和γ-TRuC，BBζ CAR释放的因子水平变化较大，可能是由于细胞内信号的差异导致。

TRuC-T和CAR-T细胞的激活信号不同

因为TRuC-T和CAR-T的胞内信号差异因此接下来研究了它们对于T细胞的激活是否有差异；当TRuC-T和CAR-T被CD19阳性的靶细胞刺激后ε-TRuC、C28ζ CAR和BBζ CAR表达CD69/CD25的比例达到60-66%，γ-TRuC为50%（图a）；TRuC-T在被抗原刺激后可以很快检测到CD3ε的磷酸化，并且可以检测到LAT的磷酸化，而CAR-T中则未能检测到这些信号，这说明TRuC-T和CAR-T在早期激活信号的差异（图b）；T细胞在静息时是保持抑制状态，TCR复合物胞内的ITAM是很难被激酶接触，即使在TCR中整合了TRuC后T细胞依旧保持抑制状态而CAR-T则可以检测到CD3ζ的磷酸化（图c）。这也与之前提到的CD69的表达相一致，CAR-T的基础tonic信号更高。

TRuC-T在小鼠模型中的抑瘤效果

因为比较的是CD19的抗体所以使用CD19阳性Raji细胞的皮下肿瘤模型同步比较了TRuC-T和CAR-T的抑瘤效果。下图可见ε-TRuC-T剂量依赖的抑瘤效果，在同等剂量下都优于C28ζ CAR和BBζ CAR。

使用静脉注射表达luciferase的Raji细胞或者Nalm6-LUC细胞建立小鼠活体成像模型，都可以发现TRuC-T的抑瘤效果优于C28ζ CAR和BBζ CAR。其中Nalm6-LUC为低表达共刺激分子的肿瘤细胞系，这说明TRuC-T的肿瘤清除活性并不依赖于共刺激信号。不过CAR-T因为自带共刺激信号，因此也不依赖于肿瘤细胞表达共刺激分子。

最后研究了TRuC-T在其他靶点肿瘤中的抑瘤效果。首先使用BCMA的ScFv替换掉CD19抗体，发现TRuC-T在体外能够杀伤转染BCMA的Hela细胞，在体内模型中PRMI-8226细胞也能被TRuC-T抑制（图a，b）；然后将抗体替换成抗IL-13Rα2的VHH抗体，ε-TRuC-T可以在体外以不同的效靶比杀伤肿瘤细胞，并且能够释放IFN-γ和IL-2，在小鼠皮下瘤模型也能有长时间的抑瘤作用（图c-e）。

讨论

本文在TCR复合物的各个亚基的N端分别融合了抗体，这些TRuC都可以整合到TCR复合物中，并且不影响TCR的功能，只有在抗体结合到抗原后才会激活TCR的信号清除靶细胞。其中ε-TRuC的功能最强，可能因为每个TCR复合物中有两个CD3ε亚基；α-、β-TRuC-T较弱可能因为α-、β-TCR的N端融合抗体后增加了α-、β-TCR的长度，并不能形成良好的免疫突触排除CD45和CD148所至；而γ-TRuC与δ-TRuC的差异可能是由于它们在组成TCR复合物时的位置或者结构所决定。与CAR-T相比，TRuC-T的激活信号有所差异，TRuC-T通过TCR的信号激活T细胞，并且不依赖于共刺激信号，而CAR-T由于自带共刺激信号，并不需要TCR的信号就能激活T细胞，同时由于CAR并不受T细胞抑制机制的作用因此基础tonic信号更高。另外由于TCR复合物中的各个亚基并不能单独存在，因此TRuC-T相对CAR-T可能更加安全，有文献报道在肿瘤细胞上转染了CD19 CAR导致了肿瘤的复发耐药。在体外ε-TRuC-T和γ-TRuC-T拥有与CAR-T类似的杀伤活性，但是释放更低的细胞因子；在体内ε-TRuC-T具有比CAR-T更好的抑瘤作用抑制肿瘤复发。目前临床上CAR-T在血液瘤中的效果很好，但是在实体瘤中的效果不尽人意，而使用TILs以及其他的TCR-T疗法在一些肿瘤中则有较好的临床效果，因此这似乎说明T细胞需要完整的TCR信号才能在实体瘤中有所作为这不仅仅是单独的CD3ζ和共刺激信号就能替代的了的。

参考文献

Synthetic TRuC receptors engaging the complete T cell receptor for potent anti-tumor response