RFantibody的使用
一直想做一个AI在抗体工程的应用介绍，一步一步从零开始教大家如何搭建环境部署软件以及应用软件进行抗体开发，但是不知道从哪里做起，也怕本人能力不够把大家都带进水沟里。决定还是先介绍一下RFantibody的使用吧。
先申明下，据文章报道蛋白质与抗体设计领域AI已实现原子级精度的抗体从头设计虽然成功率不高，我相信未来AI必将渗透到从药物发现到临床试验的各个环节。不过现阶段麻烦各个大佬们出门吹牛逼的时候还是收着一点啊，真有被忽悠瘸的老科学家们就像超市排队等鸡蛋的大爷大妈们一样在准备迎接这新一波AI带来的革命。在他们眼里AI就像许愿池，开会的时候不论啥主题都会对着抗体工程的一顿许愿，每次到这我们只能脖子一缩避而不答。
RFantibody文章就不介绍了，估计大家都看过。RFantibody是一个用于设计常规抗体和单域抗体（VHH）CDR的计算机模拟工具。下面是大概的原理，RFdiffusion先设计抗体的骨架，ProteinMPNN根据骨架结构优化氨基酸序列，最后RFantibody预测抗体抗原结合的结构筛选上一轮的复合物结构。
软件的安装使用也比较简单，详见github网站。今天我简单的复现一下使用RFantibody生成阻断性的抗PD-1的VHH抗体。
抗体模板准备：
首先我们需要准备两个结构文件，抗体的模板和目标抗原。
抗体的模板，建议选择多个抗体框架，因为不同的框架往往能够支持不同类型的CDR环结构——引入更多的多样性，也就意味着有更多机会命中目标。也可以从rcsb数据库里面选，这样也会更明确。无论是传统抗体还是VHH，最终裁剪为仅包含VH和VL区域或者仅包含 VH 区域。我这边做演示就随机挑了一条HAS的抗体，将抗体的序列先用alphaflod建个模型。
需要确认抗体PDB结构中的注释方式是Chothia，我不确定是不是就直接处理了一下。
python3 ImmunoPDB.py -i HSA_VHH.pdb -o chothia_vhh.pdb --scheme chothia
然后将结构文件进行HLT重标记做为RFantibody的输入。
python3 ~/soft/RFantibody/scripts/util/chothia2HLT.py chothia_vhh.pdb -H H -o HLT_chothia_vhh.pdb
抗原准备：
将抗原的结构文件准备好，可以直接从RCSB数据库下载，这里可以根据文献报道来确认你想结合的表位，我选取的是K药结合PD-1的表位。
RFdiffusion
这一步是根据前面准备的抗体和抗原生成复合物的结构。这里的loop长度是CDR根据chothia标记的长度，CDR3的长度可以选一个较大的范围；
同时还需要指定“热点”（hotspot）残基，这是抗体应直接接触的位置，这些残基的编号依据输入的模板结构中的编号；-n是输出抗体结构的数目。
rfdiffusion -t pd1.pdb -f HLT_chothia_vhh.pdb -o ./rfd -n 10 -l "H1:7,H2:6,H3:12-16" -h "C68,C75,C78"
运行完成后，将看到输出文件。此时，可以在 PyMOL 中查看，现阶段还没有侧链。不过可以查看整体对接情况和 CDR 环的构象，以初步判断设计是否合理。
ProteinMPNN
现在使用上一步的主链结构来设计序列，ProteinMPNN 的功能就是通过一个蛋白质的主链来预测可以折叠成该结构的序列，一个主链结构可以生成多条序列，同时也可以将温度调高来获得序列的多样性，但是如果温度太高的话设计的序列质量也会相应的下降。
proteinmpnn -i ./rfd/ -o ./proteinM/ -l "H1,H2,H3" -n 5 -t 0.2
RF2
RF2是针对抗体微调的模型，可以对刚设计的序列进行结构预测，然后评估 RF2是否确信该序列能够按照我们的设计进行结合。
rf2 -i ./proteinM/ -o ./rf2/
结果分析
首先可以用pymol打开RF2的结构与RFdiffusion的结构进行直观的比较。挑了一些看了一下，感觉都不太真实，就没贴图了。
然后将RF2预测的PDB文件的序列以及对应的打分提取出来，置信程度高的并不多，这几个属于勉强能看的。
也可以使用AF3来预测设计的模型，文章中也发现AF3的 ipTM 指标与实验结合效果的相关性更好。我随机挑了两条，用AF3建模看看，两条的ipTM分别为0.15和0.16…
这边都没敢怎么做就生成一堆数据，估计谁都没耐心一条一条看过去，从序列上看差异主要在CDR部分，直接建库筛选不仅可以增加筛选的通量还能通过CDR的交叉获得更多的可能性。不过即使筛选下来拿到了binder后面可能还得做其他没完没了的改造比如亲和力成熟、稳定性、溶解度或者PK优化等等，整个周期以及筛选改造的花费不比免疫的更少，你还不如老老实实的做动物免疫。按照文章里面的成功率想通过一顿操作就直接拿到活性符合要求成药性符合要求的抗体真的比中彩票还难。
